SDF-1-CXCR7在內(nèi)皮祖細(xì)胞參與血管生成中的作用研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在許多生理、病理的血管生成過程中發(fā)揮著重要的作用。EPCs從骨髓中動(dòng)員、歸巢到血管新生部位,參與血管生成是一個(gè)受到微環(huán)境中多因素調(diào)節(jié)的級(jí)聯(lián)動(dòng)態(tài)過程?；|(zhì)衍生因子(StromaDerived Factor1,SDF-1)在促進(jìn)EPCs動(dòng)員、歸巢和新生血管形成等環(huán)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。過去的研究一直認(rèn)為CXCR4是SDF-1的唯一作用受體,并且是調(diào)節(jié)SDF-1介

2、導(dǎo)的生物學(xué)行為的唯一調(diào)節(jié)因子。然而,近年來研究發(fā)現(xiàn)SDF-1的作用受體除了CXCR4,還有另一新的作用受體CXCR7,并.RCXCR7與SDF-1的親和能力還高于CXCR4。CXCR7的發(fā)現(xiàn)讓研究者不得不重新審視SDF-1的作用機(jī)制。在血管生成過程中,CXCR7的作用尚不明確,尤其是在EPCs中的作用還未見報(bào)道?？疾霤XCR7在EPCs參與血管生成中作用的一個(gè)關(guān)鍵問題就是構(gòu)建一個(gè)合適的血管生成模型,而血管生成是血管細(xì)胞與微環(huán)境微流相互作

3、用的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程,傳統(tǒng)的體外血管生成模型很難將這一復(fù)雜過程體外再現(xiàn),因此需要尋求新的研究手段。近年來隨著微流控技術(shù)的發(fā)展,為體外構(gòu)建一個(gè)模擬在體微環(huán)境的血管生成模型提供了可能。本研究以EPCs為研究對(duì)象,利用近年發(fā)展起來的微流控技術(shù)體外構(gòu)建血管生成模型并結(jié)合體外細(xì)胞行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究CXCR7在SDF-1介導(dǎo)的EPCs參與血管生成過程中的作用,并初步探討其作用機(jī)制,以期為血管生成相關(guān)疾病的治療提供新的作用靶點(diǎn)。本文的主要研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如

4、下:
　　 ①采用密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞,并結(jié)合差時(shí)貼壁法,收集24h后未貼壁細(xì)胞,然后用添加有SingleQuots多種細(xì)胞因子的EBM-2內(nèi)皮特異性培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取EPCs。通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞表面特異性抗原標(biāo)記鑒定和攝取功能等多種方法對(duì)EPCs進(jìn)行鑒定分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在EBM-2內(nèi)皮特異性培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后,出現(xiàn)類似于血島樣的細(xì)胞集落,集落中央的細(xì)胞呈圓形,周邊的細(xì)胞呈放射狀;采用EPCs表面

5、特異性抗原標(biāo)記CD133和VEGFR2進(jìn)行免疫熒光染色鑒定細(xì)胞的表型,結(jié)果80％以上的細(xì)胞都是CD133+/VEGFR2+細(xì)胞,并且這些細(xì)胞同時(shí)能夠攝取Ac-LDL和結(jié)合UEA-1。以上結(jié)果表明,密度梯度離心法結(jié)合差時(shí)貼壁的方法從骨髓中分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞,然后經(jīng)EBM-2條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得較高純度的EPCs,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 ②通過RT-PCR,Western-blotting和流式細(xì)胞術(shù)法分別從RNA水平、

6、蛋白質(zhì)水平以及膜上表達(dá)情況分別考察了EPCs中CXCR7的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR7和CXCR4均高表達(dá)于EPCs中。通過抗體中和法和小分子拮抗劑分別將CXCR7和CXCR4進(jìn)行封閉阻斷,體外考察CXCR7和CXCR4在SDF-1介導(dǎo)的EPCs粘附、增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成中所扮演的角色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4和CXCR7均在SDF-1調(diào)節(jié)EPCs粘附、跨內(nèi)皮遷移、增殖和管樣結(jié)構(gòu)形成起著重要作用,SDF-1調(diào)節(jié)EPCs的趨化遷移是通過CX

7、CR4作用的,而在調(diào)節(jié)EPCs在應(yīng)激條件下的存活是通過與CXCR7作用。
　　 ③建立一個(gè)與生理相關(guān)的體外血管生成模型是血管生成研究的基礎(chǔ)。本研究利用近年發(fā)展起來的微流控技術(shù)結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)三維的血管生成模型,該模型能實(shí)現(xiàn)以下幾個(gè)功能:
　　 √能模擬在體血液流動(dòng),提供流體剪應(yīng)力加載刺激；
　　 √能為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供一個(gè)3D生長(zhǎng)環(huán)境,并且能在3D微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)可溶性因子的梯度分布；
　　 √能評(píng)價(jià)

8、內(nèi)皮細(xì)胞的活力、增殖和自組織等行為；
　　 √可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)跟蹤內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡。
　　 通過考察促血管生長(zhǎng)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和形成管樣結(jié)構(gòu)形成能力的影響來評(píng)價(jià)該系統(tǒng)用于體外血管生成模型研究的可行性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在促血管生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)下,內(nèi)皮的增殖能力顯著提高并能形成復(fù)雜的管腔樣結(jié)構(gòu),同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在促血管生長(zhǎng)因子濃度梯度的誘導(dǎo)下,內(nèi)皮細(xì)胞高濃度的區(qū)域內(nèi)遷移,侵入3D基質(zhì)中內(nèi)皮細(xì)胞也組織成血管網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)果表明該系統(tǒng)可以為

9、體外的血管生成機(jī)理研究提供一個(gè)良好的研究平臺(tái),同時(shí)也為血管藥物的初步篩選提供一個(gè)可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 ④利用基于微流控芯片的血管生成模型,考察CXCR7和CXCR4在SDF-1誘導(dǎo)EPCs摻入胞外基質(zhì)及在胞外基質(zhì)中形成血管樣結(jié)構(gòu)的作用,并初步探討其作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SDF-1濃度梯度誘導(dǎo)下,當(dāng)CXCR7或CXCR4其中任何一個(gè)受到拮抗劑抑制后,EPCs摻入基質(zhì)的能力都受到顯著的抑制,并且發(fā)現(xiàn)SDF-1誘導(dǎo)EPCs在3D基質(zhì)

10、膠中形成血管樣結(jié)構(gòu)也是通過與受體CXCR4和CXCR7共同作用實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),MMP的抑制劑GM6001明顯抑制SDF-1誘導(dǎo)EPCs摻入到細(xì)胞外基質(zhì)和形成血管樣結(jié)構(gòu),與CXCR7或CXCR4的小分子拮抗劑的效果相當(dāng),而我們實(shí)驗(yàn)室的另一研究小組發(fā)現(xiàn)SDF-1能促進(jìn)MMP2的分泌,但當(dāng)加入CXCR4或CXCR7拮抗劑后,MMP2的分泌顯著下降。通過這些研究結(jié)果,我們推測(cè),SDF-1誘導(dǎo)EPCs摻入胞外基質(zhì)和形成血管樣結(jié)構(gòu)的一個(gè)可能途徑

11、就是促進(jìn)MMP的分泌,降解胞外基質(zhì),從而有利于EPCs的遷移,而SDF-1介導(dǎo)的MMP的分泌可能是通過與其兩個(gè)受體CXCR4,CXCR7聯(lián)合作用而實(shí)現(xiàn)的,并不是通過其中的某一個(gè)受體而發(fā)揮作用。
　　 綜合以上研究結(jié)果,我們推斷出如下結(jié)論:CXCR7和CXCR4在SDF-1介導(dǎo)EPCs參與血管生成的過程中發(fā)揮著不完全一致卻又缺一不可的作用:在調(diào)節(jié)EPCs粘附、摻入基質(zhì)、跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)移和形成血管樣結(jié)構(gòu)的過程中,CXCR7和CXCR4共同

12、參與調(diào)節(jié);而在EPCs趨化遷移過程中,SDF-1僅通過與受體CXCR4相互作用而發(fā)揮作用;SDF-1調(diào)節(jié)EPCs在應(yīng)激條件下的存活能力是通過受體CXCR7而不是CXCR4相互作用而實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果表明CXCR7在EPCs歸巢和參與血管生成的過程中發(fā)揮著重要的作用,可能是血管生成相關(guān)疾病治療的又一新靶點(diǎn)。另外,本研究基于微流控技術(shù)構(gòu)建的血管生成模型不僅可以為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供一個(gè)近似于在體的生長(zhǎng)環(huán)境,同時(shí)還能實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞的行為響應(yīng),為血管生成