保護性基因血紅素加氧酶-1在減輕肝臟缺血再灌注損傷中的機制研究.pdf

1、根據(jù)最新研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞在心、腦、腸等器官的缺血再灌注損傷中發(fā)生脫顆粒并且能加重缺血再灌注損傷，推斷肥大細胞在肝臟缺血再灌注損傷中也發(fā)生脫顆粒并且加重局部損傷，再結合機體自身保護性基因血紅素加氧酶-1（HO-1）參與免疫調控，具有抗炎、抗過敏、抗凋亡等作用，從而提出機體保護性基因HO-1減輕肝臟缺血再灌注損傷的可能途徑：抑制肥大細胞脫顆粒。以大鼠肝臟缺血再灌注損傷為研究對象，運用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、western bl

2、ot 等技術檢測肝臟HO-1核酸水平、蛋白水平的變化，常規(guī)檢測外周血中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶的變化等指標，甲苯胺藍染色檢測肝臟中肥大細胞性狀和數(shù)量的變化，HE染色檢測肝臟組織損傷變化，免疫組化技術檢測Kupffer細胞功能變化，綜合評價上述變化對肝臟缺血再灌注損傷的影響，在體驗證上述理論推測，為闡明HO-1與肥大細胞在肝臟I/RI中的作用機制，并為臨床防治肝臟缺血再灌注損傷提供新的調控靶點。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：

3、HO-1表達和肥大細胞脫顆粒在肝臟缺血再灌注損傷中的變化觀察。
　　 目的：研究肝臟缺血再灌注損傷過程中大鼠肝臟保護性基因血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達以及肥大細胞脫顆粒的變化。
　　 方法：將實驗雄性SD大鼠隨機分為8組，每組5只：假手術組(Sham組)、1h組、2h組、4h組、6h組、8h組、12h組、24h組。實驗動物經(jīng)麻醉消毒開腹后，暴露肝門部，采用無損傷血管夾夾閉左中葉肝蒂1h后放開，分別于再灌注后1h、2

4、h、4h、6h、8h、12h、24h取外周血標本和肝臟組織標本，Sham組只開腹不做其他處理。RT-PCR法檢測肝組織中HO-1 mRNA的表達變化；采用Western blot法檢測肝組織中HO-1蛋白表達變化；常規(guī)檢測外周血中轉氨酶水平的變化。病理切片染色檢測肝臟中肥大細胞性狀和數(shù)量的變化。
　　 結果：肝臟缺血再灌注后，實驗組HO-1 mRNA表達、HO-1蛋白表達、外周血轉氨酶水平以及肥大細胞脫顆粒數(shù)明顯高于Sham組，

5、其中6h組和8h組HO-1 mRNA表達、蛋白表達以及外周血轉氨酶水平最高，其差別有統(tǒng)計學意義,P <0.05；而2h組肥大細胞脫顆粒數(shù)量最多，其差異具有統(tǒng)計學意義,P <0.05。
　　 結論;本實驗結果表明肝臟HO-1表達隨著再灌注時間的增加成拋物線趨勢，再灌注6-8h表達最高；肝臟缺血再灌注損傷過程中有肥大細胞發(fā)生脫顆粒，并且再灌注2h脫顆粒數(shù)量最多，這部分實驗為后續(xù)探討HO-1與肥大細胞脫顆粒之間的關系提供了時間依據(jù)。<

6、br>　　 第二部分：上調HO-1表達抑制肥大細胞脫顆粒減輕肝臟缺血再灌注損傷。
　　 目的：缺血再灌注損傷(I/RI)是許多肝臟手術后造成器官損害的原因之一。探索肝臟I/RI的機制，減輕或防止再灌注損傷的發(fā)生，是肝臟疾病防治中亟待解決的重要課題。為了闡明HO-1與肥大細胞在肝臟I/RI中的作用機制，利用大鼠肝臟I/RI模型，深入探討肝臟中HO-1減輕肝臟I/RI的可能途徑：抑制肥大細胞脫顆粒作用。
　　 方法：將實驗

7、雄性SD大鼠隨機分為4組(n=5)： （1）假手術組（Sham組），（2）缺血再灌注損傷組（I/RI組），（3）HO-1誘導劑鈷原卟啉組（CoPP組），（4）HO-1抑制劑鋅原卟啉組（ZnPP組）。實驗動物經(jīng)麻醉消毒開腹后，暴露肝門部，采用無損傷血管夾夾閉左中葉肝蒂1h后放開，分別于再灌注后2h取外周血標本和肝臟組織標本。RT-PCR法檢測肝組織中HO-1 mRNA的表達變化；采用Western blot法檢測肝組織中HO-1蛋白表達變

8、化；常規(guī)檢測外周血中轉氨酶水平；病理切片甲苯胺藍染色檢測肝臟中肥大細胞性狀和數(shù)量的變化；HE染色檢測肝臟細胞損傷情況。
　　 結果：與Sham組相比，I/RI組、CoPP組、ZnPP組肝臟組織HO-1mRNA表達增加，血清ALT、AST水平升高，肥大細胞脫顆粒數(shù)量增多，肝臟細胞損傷加重。與I/RI組相比，CoPP組HO-1mRNA表達增加，血清ALT、AST水平減低，肥大細胞脫顆粒數(shù)量減少，肝細胞損傷減輕；ZnPP組HO-1mR

9、NA表達減少，血清ALT、AST水平升高，肥大細胞脫顆粒數(shù)量增多、肝細胞損傷嚴重。組間比較差異具有統(tǒng)計學意義,P <0.05。
　　 結論：本實驗結果表明預先提高肝臟HO-1的表達能減輕缺血再灌注損傷，其作用的可能途徑是抑制肝臟中肥大細胞脫顆粒。
　　 第三部分：HO-1在肝臟中減輕缺血再灌注損傷的細胞定位研究。
　　 目的：正常狀態(tài)下的肝臟組織HO-1的表達量總是比其他實質性臟器為高。深入探討HO-1在肝臟中減

10、輕缺血再灌注損傷的細胞來源對于肝臟缺血性相關疾病提供治療靶點具有重要意義。
　　 方法：將實驗雄性SD大鼠隨機分為4組(n=5)：假手術組(Sham組)、缺血再灌注損傷組(I/RI組)、GdCL3組、GdCL3+HO-1誘導劑鈷原卟啉組（GdCL3+CoPP組）。實驗動物經(jīng)麻醉消毒開腹后，暴露肝門部，采用無損傷血管夾夾閉左中葉肝蒂1h后放開，分別于再灌注2h后取外周血標本和肝臟組織標本。免疫組化檢測ED2抗原的表達，RT-PCR

11、法檢測肝組織中HO-1 mRNA的表達變化；采用Western blot法檢測肝組織中HO-1蛋白表達變化；病理切片甲苯胺藍染色檢測肝臟中肥大細胞性狀和數(shù)量的變化。HE染色檢測肝臟細胞損傷情況。
　　 結果：GdCL3組、GdCL3+CoPP組ED2抗原表達明顯減少，HO-1 mRNA表達、蛋白表達明顯降低，肥大細胞脫顆粒增多，肝臟損傷加重。與缺血再灌注損傷組相比，其差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。
　　 結論：本實驗