CaMEK基因靶向轉導減輕老齡心肌缺血再灌注損傷的機制研究.pdf

1、目的:本研究旨在探討年齡因素對缺血后適應心肌保護作用的影響，研究老齡缺血后適應心肌保護作用消失的分子機制;通過研究巨細胞病毒(CMV)啟動子與雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子重組AAV9載體的組織表達特異性，篩選獲得較好的可用于心臟疾病基因治療的AAV9載體;并使用攜帶CaMEK(CaMEK)基因的重組AAV9載體，靶向轉導老齡小鼠心臟，探討外源導入CaMEK能否作為基因治療藥物，具有靶向激活ERK1/2通路，減少心肌梗死、抑制心肌細胞凋

2、亡、防治老齡心肌缺血再灌注損傷的作用及機制。本研究包括:①應用小鼠Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)，對比研究缺血后適應對年輕與老齡小鼠心肌保護作用的差異，闡明缺血后適應心肌保護作用年齡異質性的分子機制。②通過體內外轉導實驗，對比研究桿狀病毒載體系統(tǒng)包裝制備的CMV與CBA啟動子的重組AAV9載體介導GFP基因在小鼠體內的組織表達特異性、表達時間點、安全性，篩選更適宜用于心臟疾病基因治療的重組AAV9載體。③靶向轉導CaMEK基因至

3、老齡小鼠心肌，通過離體及在體心肌缺血再灌注模型，探討CaMEK基因過表達減輕老齡心肌缺血再灌注損傷的作用機制。
　　方法:
　　第一部分:選取3～4月齡和15～18月齡的雄性C57BL/6J小鼠，建立Langendorff離體心臟缺血后適應模型，離體再灌注(IR)心臟經(jīng)受45 min全心缺血和60 min再灌注，缺血后適應(IPost)于再灌注即刻給予3個循環(huán)10s缺血+10s再灌注的IPost處理，同時年輕小鼠給予PD98

4、059（ERK1/2抑制劑）。觀測指標為心肌梗死面積、心肌細胞凋亡、p-ERK1/2、p-P70S6K及p-AKT的表達。
　　第二部分:將劑量為1×1011vg的AAV9-CMV-eGFP及AAV9-CBA-eGFP載體分別經(jīng)尾靜脈注射導入C57BL/6小鼠體內，于病毒載體轉導0周、1周、2周、3周、4周、5周和8周，利用激光共聚焦和Western Blot檢測心、肝、脾、肺、腎、腦及骨骼肌中GFP蛋白表達;通過q-PCR檢測A

5、AV9載體在不同組織中的拷貝數(shù)，研究AAV9病毒顆粒的體內分布與存在時間，系統(tǒng)評價CMV與CBA啟動子重組AAV9載體的組織靶向性;通過檢測心肌酶、肝功及腎功能指標，評價AAV9載體轉導的安全性。在細胞水平上，利用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞及BRL-3A大鼠肝細胞株，分別以不同感染復數(shù)(MOI=105、106、107)的AAV9-CMV-eGFP及AAV9-CBA-eGFP載體進行轉染，利用熒光顯微鏡和流式細胞儀測定AAV9載體的體外轉染效

6、率，同時采用TUNEL染色檢測心肌細胞和肝細胞的凋亡率。
　　第三部分:選取15～18月老齡雄性C57BL/6J小鼠，分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水，AAV9-CMV-eGFP和AAV9-CMV-CaMEK，5周后采用Western Blot法檢測心肌中MEK、p-ERK1/2、p-P90RSK的表達;并于病毒轉染5周后，采用Langendorff離體心臟灌流模型及小鼠在體缺血再灌注損傷模型，離體心臟處理同第一部分;在體心臟經(jīng)受60 m

7、in局部缺血和24 h再灌注，觀察指標為心肌梗死面積、細胞凋亡，心肌酶CK、CK-MB、LDH，Bcl-2、Bax的表達。
　　結果:
　　第一部分:①與直接缺血再灌注相比，缺血后適應可使年輕小鼠心肌的梗死面積顯著降低（39.7±4.6％ vs24.9±2.9％，P＜0.01）;且心肌細胞凋亡亦顯著下降（12.2±1.8％vs7.7±1.3％，P＜0.01）。②缺血后適應對老齡小鼠心肌沒有保護作用，IR組和IPost組的心肌

8、梗死面積為(49.5±7.5％ vs47.5±7.3％，P＞0.05)，心肌細胞凋亡率為（13.5±2.3％ vs13.7±2.4％，P＞0.05），且老齡組小鼠心肌梗死面積顯著高于年輕組（P＜0.01）。③缺血后適應通過再灌注早期誘導年輕小鼠心肌p-ERK1/2、p-P70S6K表達的增加，但是對老齡小鼠心肌卻沒有這項效應，使用ERK1/2特異性抑制劑PD98059使缺血后適應對年輕小鼠心肌的保護作用完全消失，同時缺血后適應均未誘導年

9、輕和老齡小鼠心肌p-AKT表達的增加。
　　第二部分:①激光共聚焦和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)CMV與CBA重組AAV9載體轉導5周時，GFP蛋白主要在小鼠心肌和肝臟中表達，而脾、肺、腎、腦及骨骼肌中幾乎未見表達。②各檢測時間點CMV啟動子所介導的GFP蛋白在心肌中的表達顯著高于肝臟。AAV9載體轉導1周后心肌和肝臟中開始表達GFP蛋白，隨著時間的延長表達逐漸增強，轉導第5周到達高峰，其在心臟和肝臟轉染效率84.0±3.2％

10、vs23.6±3.4％，(P＜0.01)，第8周時為75.0±3.5％ vs2.2±0.3％，(P＜0.01)，表明AAV9-CMV-eGFP載體對心肌有極強的靶向親和力，可在心肌中長期穩(wěn)定的高效表達，但CMV啟動子活性在肝臟中很容易被沉默。③AAV9-CBA-eGFP載體有極強的嗜肝性，各觀察點其在肝臟中的表達顯著高于心肌，亦隨著時間的延長而增強，5周時表達至高峰，此時肝臟和心臟的轉染效率88.0±3.9％ vs7.7±0.7％，(P

11、＜0.01)，第8周時為84.4±2.4％ vs6.4±0.4％，(P＜0.01)。④在各檢測點，q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CMV啟動子的AAV9載體在心肌中的分布顯著高于CBA啟動子，而在肝臟中則顯著低于CBA啟動子(P＜0.01)，迸一步證實AAV9-CMV-eGFP載體的嗜心肌性、AAV9-CBA-eGFP載體的嗜肝性。⑤生化檢測發(fā)現(xiàn)AAV9載體轉導對心肌酶LDH、CK，肝功能AST、ALT，腎功能Cr及BUN無不良影響。⑥流式細胞儀檢測

12、表明CMV和CBA啟動子的AAV9載體均可高效的轉染心肌細胞和肝細胞，且隨著感染劑量的增加而逐漸增強，但是相同感染劑量下相比，兩啟動子對心肌細胞的轉染效率無明顯差異，對肝細胞亦無顯著差異。⑦與未轉染細胞相比，高劑量CMV與CBA啟動子的AAV9載體轉染并未導致的心肌細胞和肝細胞凋亡。
　　第三部分:①CaMEK基因轉導可高效激活老齡小鼠心肌ERK1/2信號通路，與對照和空病毒組相比，MEK、p-ERK1/2、p-P70S6K和p-

13、P90RSK的表達顯著增加。②對于離體心臟研究，CaMEK基因過表達有效保護老齡缺血心肌。空病毒組、CaMEK基因轉導組IR與IPost的心肌梗死面積分別為48.0±7.7％ vs44.0±8.0％、31.3±5.3％ vs28.5±6.5％，心肌細胞凋亡率分別為14.3±2.1％ vs13.6±1.9％、5.0±1.3％vs4.9±1.2％，心梗面積及細胞凋亡率與空病毒組相比差異均有統(tǒng)計學意義，表明ERK1/2信號通路激活后有效保護老

14、齡缺血心肌。③對于在體心臟研究，CaMEK基因過表達同樣可有效降低老齡小鼠心肌梗死面積和心肌細胞凋亡率。老齡小鼠心肌缺血1h，再灌注24h后，Control、空病毒及CaMEK三組的心梗面積分別為44.2±7.4％ vs43.4±6.0％vs27.5±4.7％;心肌細胞凋亡率分別為16.1±1.9％ vs16.4±2.0％ vs5.5±2.3％，與Control和空病毒組相比差異均有統(tǒng)計學意義;凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax顯著增加，與

15、空病毒相比P＜0.01。④CaMEK組的心肌酶CK、CK-MB、LDH亦顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　?、貳RK1/2信號通路是參與并介導缺血后適應心肌保護作用年齡異質性的關鍵靶點。缺血后適應在再灌注早期通過激活ERK1/2信號通路減輕年輕小鼠心肌缺血再灌注損傷，AKT信號通路并未參與缺血后適應的心肌保護作用;②缺血后適應對老齡小鼠心肌沒有保護作用與ERK1/2信號通路未有效激活有關，且老齡小鼠心肌對缺血再灌注

16、損傷的敏感性顯著增加，再灌注后心肌梗死面積顯著增加。③CMV啟動子的重組AAV9載體可在小鼠心肌中長期穩(wěn)定的高效率表達，但在肝臟中CMV啟動子活性很容易被沉默，AAV9-CMV載體是一種較為理想的心臟疾病基因治療載體;④CBA啟動子的重組AAV9載體對肝臟有極高的親嗜性，可介導外源基因在肝臟中長期穩(wěn)定的高效表達，是較為理想的肝臟疾病基因治療載體系統(tǒng)。⑤靶向激活心肌ERK1/2信號通路激發(fā)心肌內源性抗損傷能力是防治老齡心肌缺血再灌注損傷的