喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶急性損傷修復(fù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著嗓音外科學(xué)的不斷發(fā)展，嗓音外科醫(yī)生可在顯微鏡下通過激光等方法切除聲帶不良病變，但術(shù)中易造成聲帶固有層損傷，導(dǎo)致固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分的含量及分布發(fā)生改變從而形成瘢痕。如何減少瘢痕的形成，一直是困擾研究人員的重要問題。既往有學(xué)者通過在動(dòng)物聲帶內(nèi)注射各種干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪基質(zhì)干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞等修復(fù)聲帶損傷，然而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材時(shí)患者較為痛苦，不宜反復(fù)取材，脂肪基質(zhì)干細(xì)胞雖易取材，但其組織來源與聲帶組織結(jié)構(gòu)差異大，胚胎干

2、細(xì)胞的應(yīng)用仍存在倫理方面的問題等，因此限制了這些細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。
　　近年來研究人員已證實(shí)在高等動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在著間充質(zhì)干細(xì)胞，喉黏膜因其范圍廣，取材相對(duì)方便，且此部位細(xì)胞的組織來源與聲帶組織結(jié)構(gòu)最為接近，不存在倫理方面的問題，因此我們?cè)O(shè)想喉黏膜中是否同樣存在間充質(zhì)干細(xì)胞。若能成功分離此種細(xì)胞，并將其用于喉部組織的缺損修復(fù)，將會(huì)為聲帶損傷的患者帶來新的希望。因此前期實(shí)驗(yàn)中劉陽(yáng)已成功從人喉黏膜中培養(yǎng)出具有快速增殖能力及多向分化潛

3、能的間充質(zhì)干細(xì)胞，命名為喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(LM-MSCs)。本實(shí)驗(yàn)的研究目的是將LM-MSCs應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察LM-MSCs在受損聲帶內(nèi)的存活情況及轉(zhuǎn)歸，并在形態(tài)及組織學(xué)水平觀察其對(duì)聲帶損傷的修復(fù)作用。
　　1、目的：
　　探討犬喉黏膜中是否存在間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，將其植入犬受損聲帶，觀察LM-MSCs在聲帶內(nèi)的存活及轉(zhuǎn)歸，并評(píng)估其對(duì)聲帶損傷的修復(fù)作用。
　　2、方法：
　　2.1、犬喉黏

4、膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　犬處死后取材，獲取正常會(huì)厭舌側(cè)黏膜，利用消化培養(yǎng)法獲得黏膜固有層細(xì)胞，利用成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)液對(duì)其多向分化的能力進(jìn)行研究，通過MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成試驗(yàn)觀察LM-MSCs的生物學(xué)特性及通過流式細(xì)胞儀對(duì)LM-MSCs表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　2.2、犬聲帶激光損傷模型的建立
　　中華田園犬5只，其中4只在支撐喉鏡下挑起會(huì)厭顯露雙側(cè)聲帶，局部噴少量利多卡因，半導(dǎo)體激光雙側(cè)對(duì)稱性

5、切除聲帶膜部中后1/3處，深度達(dá)甲杓肌，雙側(cè)對(duì)稱，1只犬未損傷作為對(duì)照組。術(shù)后觀察雙側(cè)聲帶的大體愈合情況，如充血、水腫、損傷表面的不規(guī)則性，有無萎縮及瘢痕形成。分別于術(shù)后4d、2w、4w及8w聲帶取材，左側(cè)聲帶行石蠟切片(厚度約5μm)，HE染色觀察聲帶損傷處炎性細(xì)胞侵潤(rùn)及纖維組織增生情況，Masson trichrome染色、Elastin VG染色、Alcian blue染色分別觀察膠原纖維、彈力纖維、透明質(zhì)酸的分布與含量變化，右側(cè)

6、聲帶行冰凍切片(厚度約5μm)并行纖維連接蛋白(Fibronectin)免疫組化染色觀察fibronectin的含量變化。
　　2.3、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶急性損傷修復(fù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　2.3.1、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)聲帶大體愈合情況的影響
　　取第3代LM-MSCs，Dil熒光染料標(biāo)記后備用，中華田園犬10只，支撐喉鏡下半導(dǎo)體激光損傷雙側(cè)聲帶膜部中后1/3，深度達(dá)甲杓肌，損傷后即行聲帶注射術(shù)，左側(cè)聲帶注射0.

7、2ml LM-MSCs與膠原的混合物(約含2×106個(gè)細(xì)胞)作為干細(xì)胞組，右側(cè)聲帶僅注射0.2ml膠原作為對(duì)照組。對(duì)10只犬隨機(jī)分組，1-6號(hào)犬分別于術(shù)后2w、4w及8w在支撐喉鏡下觀察受損聲帶愈合的情況，如充血、水腫、損傷表面的不規(guī)則性，有無萎縮及瘢痕形成。
　　2.3.2、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)聲帶固有層結(jié)構(gòu)的影響
　　將犬處死取材，行冰凍切片后，并行免疫組化染色觀察fibronectin的含量變化，石蠟切片HE染色觀察聲

8、帶固有層炎性細(xì)胞侵潤(rùn)及纖維組織增生情況，并行Masson trichrome染色、EVG染色、Alcian blue染色觀察聲帶固有層中膠原纖維、彈力纖維及透明質(zhì)酸(HA)的排列及含量改變。
　　2.3.3、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶內(nèi)存活的情況
　　1-6號(hào)犬聲帶行冰凍切片后，用Hochest熒光染料襯染聲帶組織細(xì)胞核15min，PBS沖洗切片，熒光顯微鏡下觀察植入的LM-MSCs在聲帶內(nèi)存活及分布的情況，觀察植入的LM-M

9、SCs隨時(shí)間的推移存活數(shù)量的變化。
　　2.3.4、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶內(nèi)的轉(zhuǎn)歸
　　術(shù)后4w及8w分別處死2只犬(7-10號(hào))觀察干細(xì)胞在聲帶內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，冰凍切片后行免疫熒光Vimentin染色及Smooth musle actin染色，二抗帶FITC熒光，熒光顯微鏡下觀察植入的LM-MSCs在聲帶組織中轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞的能力，植入的LM-MSCs本身呈紅色熒光，若在藍(lán)光的激發(fā)下同時(shí)可呈綠色熒光，證明其可轉(zhuǎn)

10、化為成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞。
　　3、結(jié)果：
　　3.1、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　原代培養(yǎng)的LM-MSCs在3d左右貼壁生長(zhǎng)，起初成短梭狀，隨后細(xì)胞伸展?jié)u成長(zhǎng)梭狀，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，胞核大。在體外分別經(jīng)成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)分化后，油紅O染色陽(yáng)性，茜素紅染色陽(yáng)性，成軟骨微團(tuán)II型膠原免疫組化染色DAB顯色可觀察到陽(yáng)性信號(hào)。培養(yǎng)的LM-MSCs增殖能力強(qiáng)，增殖過程中無停滯期，接種后第3d開始處于對(duì)數(shù)

11、生長(zhǎng)期，第7d達(dá)到生長(zhǎng)峰值，第8d進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果示LM-MSCs有較高的克隆形成率約19.7％。通過流式細(xì)胞儀對(duì)LM-MSCs進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析，LM-MSCs高表達(dá)間充質(zhì)的表面分子標(biāo)志(CD29-77.6％、CD44-75.5％、CD90-97.3％、CD105-38.3％)，不表達(dá)造血系的表面分子標(biāo)志(CD34-1.8％、CD45-0.9％)。
　　3.2、犬聲帶激光損傷模型的建立
　　術(shù)后4d支

12、撐喉鏡下雙側(cè)聲帶充血、水腫，肉芽組織形成，表面不規(guī)則，組織切片HE染色示上皮未被覆固有層，損傷處可見大量炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，固有層與聲帶肌層界限不清，各種ECM成分不易檢出。術(shù)后2w喉鏡下見聲帶充血較前減輕，但仍有水腫，受損表面不規(guī)則，HE染色示新生上皮被覆受損部位，炎性細(xì)胞數(shù)量較前減少，大量纖維組織增生；ECM改變(根據(jù)切片IOD值檢測(cè))：fibronectin含量增加，膠原纖維增粗含量增加，排列紊亂，彈力纖維含量減少且變細(xì)，排列不齊，HA

13、含量下降。術(shù)后4w喉鏡可見雙側(cè)聲帶充血水腫基本消失，受損處表面不規(guī)則，萎縮形成，HE染色示固有層無炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，且被致密的纖維組織所替代；ECM改變：fibronectin含量持續(xù)增加，膠原含量增加，排列紊亂，彈力纖維含量略下降，且排列不齊，HA含量下降。術(shù)后8w喉鏡可見雙側(cè)聲帶無明顯充血水腫，損傷表面不規(guī)則，局部萎縮，瘢痕修復(fù)；ECM改變：fibronectin含量略上升，膠原纖維呈粗大條索狀，含量增加排且列紊亂，彈力纖維含量趨于穩(wěn)定

14、，HA含量下降。
　　3.3、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶急性損傷修復(fù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　3.3.1、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)聲帶大體愈合情況的影響
　　術(shù)后2w可觀察到雙側(cè)聲帶水腫，稍充血，表面不規(guī)則，且有肉芽形成，干細(xì)胞組聲帶肉芽形成較少，且聲帶表面較對(duì)照組規(guī)則；術(shù)后4w時(shí)雙側(cè)聲帶充血、水腫基本消失，表面稍不規(guī)則，肉芽組織不明顯，萎縮形成，對(duì)照組聲帶表面不規(guī)則性及萎縮較干細(xì)胞組明顯；術(shù)后8w時(shí)雙側(cè)聲帶無充血、水腫，無新生

15、肉芽組織形成，聲帶損傷局部可見萎縮、瘢痕形成，對(duì)照組聲帶瘢痕較干細(xì)胞組大，且萎縮明顯。
　　3.3.2、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)聲帶固有層結(jié)構(gòu)的影響
　　犬處死后聲帶取材并行組織切片觀察，2w時(shí)干細(xì)胞組聲帶固有層內(nèi)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)及纖維組織增生要小于對(duì)照組；雙側(cè)聲帶fibronectin含量持續(xù)上升，干細(xì)胞組含量略低于對(duì)照組；雙側(cè)聲帶膠原含量增加，干細(xì)胞組的膠原纖維含量稍低于對(duì)照組，且排列上較對(duì)照組規(guī)則；雙側(cè)聲帶彈力纖維含量均減少，

16、排列紊亂，干細(xì)胞組含量高于對(duì)照組；HA含量呈下降趨勢(shì)，干細(xì)胞組含量略高于對(duì)照組。4w時(shí)雙側(cè)聲帶炎性細(xì)胞侵潤(rùn)基本消失，纖維組織增生，干細(xì)胞組增生小于對(duì)照組；雙側(cè)聲帶fibronectin上升，干細(xì)胞組含量低于對(duì)照組；膠原纖維呈條索狀，含量持續(xù)增加，干細(xì)胞組較對(duì)照組含量低，排列較規(guī)則；彈力纖維含量繼續(xù)下降，纖維直徑變細(xì)，干細(xì)胞組含量稍高于對(duì)照組；HA含量下降，干細(xì)胞組含量略高于對(duì)照組。8w時(shí)雙側(cè)聲帶觀察不到炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，纖維組織增生明顯；雙

17、側(cè)聲帶fibronectin上升，對(duì)照組含量高于干細(xì)胞組；雙側(cè)聲帶膠原呈粗大條索狀，含量增加，對(duì)照組較干細(xì)胞組排列紊亂；彈力纖維含量趨于穩(wěn)定，干細(xì)胞組彈力纖維直徑較對(duì)照組粗。HA含量持續(xù)降低，干細(xì)胞組含量高于對(duì)照組。
　　3.3.3、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶內(nèi)的存活情況
　　干細(xì)胞注射術(shù)后2w、4w及8w熒光顯微鏡下觀察到植入的LM-MSCs在聲帶固有層內(nèi)存活，2w時(shí)固有層內(nèi)有大量紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞，提示此時(shí)有較多數(shù)量的移植

18、細(xì)胞存活，4w時(shí)植入的LM-MSCs存活數(shù)量較2w時(shí)明顯減少，8w時(shí)仍可觀察到存活的LM-MSCs，但數(shù)量較前明顯減少。
　　3.3.4、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶內(nèi)的轉(zhuǎn)歸
　　Vimentin免疫熒光染色，4w時(shí)熒光顯微鏡下一些呈紅色熒光的LM-MSCs在藍(lán)光的激發(fā)下同時(shí)可發(fā)出綠色熒光，提示植入的LM-MSCs可轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，同樣的方法，8w時(shí)也可觀察到一些植入的LM-MSCs轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞。Smoothmucleac

19、tin免疫熒光染色，熒光顯微鏡下可見4w時(shí)植入的LM-MSCs在藍(lán)光的激發(fā)下同時(shí)可發(fā)出綠色熒光，提示植入的LM-MSCs可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，同樣的方法，8w時(shí)未能觀察到植入的LM-MSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。
　　4、結(jié)論：
　　4.1、本實(shí)驗(yàn)利用消化培養(yǎng)法成功培養(yǎng)并鑒定了犬喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞，證明了其具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化的能力。犬喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有有較快的生長(zhǎng)增殖速度和較高的克隆形成能力，表達(dá)間充質(zhì)

20、干細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　4.2、支撐喉鏡下應(yīng)用半導(dǎo)體激光造成犬聲帶膜部損傷，術(shù)后喉鏡下可見2w時(shí)雙側(cè)聲帶充血水腫，4w時(shí)出現(xiàn)萎縮，8w時(shí)瘢痕形成，組織學(xué)示固有層內(nèi)膠原含量持續(xù)上升，排列紊亂，提示大量瘢痕組織形成，彈力纖維含量下降示聲帶組織的彈性下降，HA含量降低示聲帶振動(dòng)能力及抑制膠原無序沉積的能力下降，fibronectin含量增加示組織纖維化程度加重，以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功的建立了犬聲帶損傷模型，為后續(xù)損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的

21、動(dòng)物模型。
　　4.3.1、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞聲帶植入后，充血水腫較對(duì)照組輕。干細(xì)胞組聲帶表面較對(duì)照組規(guī)則，萎縮程度小，瘢痕形成少。
　　4.3.2、組織切片示喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞能降低固有層中膠原的沉積及無序排列，提高彈力纖維與HA含量以保證聲帶的有效振動(dòng)，且具有抑制fibronectin含量上升以減少固有層纖維化的功能，以上結(jié)果表明喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成，改變微環(huán)境修復(fù)聲帶損傷。
　　4.3