間充質(zhì)干細(xì)胞對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺保護(hù)作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)主要是由胃酸吸入、感染、創(chuàng)傷、脂肪栓塞等引起，感染是最常見原因。不論何種原因所致急性肺損傷，炎癥反應(yīng)都在其病理改變中起了主要作用。雖然，大量的研究試圖闡明急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥的發(fā)病機理，但是，至今仍沒發(fā)現(xiàn)特別有效的治療手段。目前，急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的治療上主要以支持治療、藥物治療和輔助通氣治療為主，臨床上仍然保持著很高的病死率，大約維持在

2、30％～40％，因此迫切需要深入研究其發(fā)病機制，尋找更加有效的治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)不僅具有低免疫原性、多向分化潛能、誘導(dǎo)免疫耐受、還具有免疫抑制的作用。由于MSCs具有獨特的免疫學(xué)特性及良好的可塑性，并且MSCs的利用不涉及倫理爭議，因此，到目前為止MSCs已成為細(xì)胞治療和組織工程的最佳候選細(xì)胞材料。但是，其治療機制仍然沒有完全清楚。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是近年研究較多的一個促炎因子，其在炎癥發(fā)生及調(diào)節(jié)中起了非常重要的

3、作用。近幾年的文獻(xiàn)報道，阻斷肺上皮細(xì)胞的NF-κB信號通路可以減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的粒細(xì)胞性肺炎癥反應(yīng)和肺水腫程度，是肺炎癥疾病的有效治療方法之一。親環(huán)素A(CyPA)是白細(xì)胞趨化因子，其通過與其受體CD147結(jié)合激活MAPK及核因子κB(NF-κB)通路從而調(diào)節(jié)促炎因子的釋放。目前未發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷中對NF-κB與CyPA的影響的文獻(xiàn)報道。本研究旨在研究間充質(zhì)干細(xì)胞對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的生物學(xué)作用及對

4、NF-κB與CyPA的影響，以期進(jìn)一步闡明MSCs治療ALI的機制，為臨床發(fā)現(xiàn)更有效的治療方法提供實驗線索。
　　 第一章 C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　 目的:
　　 觀察C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在體外培養(yǎng)時，細(xì)胞的鑒定、形態(tài)及定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的特點。
　　 方法:
　　 1.取C57BL/6J小鼠

5、雙側(cè)股骨和脛骨骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外全骨髓貼壁篩選法原代培養(yǎng)并傳代。
　　 2.取原代的MSCs培養(yǎng)至第7代細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察其生長形態(tài)及特征。
　　 3.提取第1、3代細(xì)胞，胰酶消化后計數(shù)，以2×103個/孔接種于96孔板，每孔加入10μl Cell Counting Kit-8(CCK-8)溶液，37℃，飽和濕度為5％CO2，培養(yǎng)箱孵育2h后，用酶聯(lián)免疫檢測儀于450nm波長下檢測吸光度值。然后在檢測后第1、2、3

6、、4、5、6、7天同一時間作相同檢測。用吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線。
　　 4.第5代生長狀態(tài)良好的C57小鼠BMSCs制成單細(xì)胞懸液，以2×103/ml濃度接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)60％融合時，分別加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液及成脂誘導(dǎo)劑進(jìn)行體外分化培養(yǎng)。
　　 5.第5代生長狀態(tài)良好的C57小鼠BMSCs制成單細(xì)胞懸液，收集約2×106個細(xì)胞上機進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代培養(yǎng)的MSCs在24h

7、后開始貼壁，48h后貼壁的MSCs逐漸伸展為不規(guī)則圓形、多角形、梭形、排列不規(guī)則。
　　 2.成骨誘導(dǎo)后鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染成橘紅色、成脂誘導(dǎo)后脂肪細(xì)胞里的脂滴呈紅色，其它細(xì)胞則不著色。
　　 3.MSCs的生長曲線呈S型，其生長周期分別為滯后期，對數(shù)期和平臺期。
　　 4.C57小鼠MSCs分化的流式細(xì)胞分析顯示:MSCs誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表面主要有Sca-1、CD34、CD29和CD44標(biāo)記分子、缺乏CD117分子

8、。
　　 結(jié)論:
　　 1.密度離心結(jié)合貼壁法可以成功培養(yǎng)、分離出C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.1×1011 L-1的細(xì)胞密度是較為理想的原代全骨髓接種密度，2×108L-1是MSCs較為理想的傳代密度。待MSCs生長到第3-4天時，細(xì)胞生長融合至80％-90％時，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞是最佳的傳代時間。
　　 3.MSCs能于體外培養(yǎng)大量擴增和存活，在增殖多代后仍然可以保持良好的細(xì)胞活性和擴

9、增能力，并于一定條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。
　　 4.MSCs誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表面主要有Sca-1、CD34、CD29、CD44標(biāo)記分子、缺乏CD117分子。
　　 第二章骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的生物學(xué)作用
　　 目的:
　　 首先觀察間充質(zhì)干細(xì)胞對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用，然后觀察其對大鼠氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響。
　　 方法:
　　 1.90只SD大鼠

10、隨機分為5組:A組:正常對照組(n=18)尾靜脈注射等量生理鹽水;B組:內(nèi)毒素組(LPS)(n=18):經(jīng)尾靜脈注射LPS5mg/kg;C組:高劑量干細(xì)胞組（BMSCH組）(n=18):經(jīng)尾靜脈注射LPS5mg/kg+BMSC2×106/ml0.5ml;D組:低劑量干細(xì)胞組（BMSCL組）(n=18):LPS5mg/kg+BMSC1×106/ml0.5ml;干細(xì)胞對照組（BMSC組）(n=18):骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2×106/ml0.5m

11、l。分別于造模后6、24、72小時，處死動物收取標(biāo)本，每個時間點6只(LPS的24小時組因1只死亡固只處死5只)。
　　 2.取右肺上葉用于測定肺濕重/干重，取右肺下葉組織（約0.5cm2）放入多聚甲醛中固定，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。取其余肺組織于生理鹽水中迅速漂洗干凈后，立即放入液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?，腹主動脈采血立即送血氣分析。分別測定肺濕重/干重、肺組織MDA、SOD、MPO、TNF-α和IL-1β。

12、　　 3.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0軟件包處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同處理組間資料均數(shù)比較采用析因設(shè)計資料的方差分析。各組間同一時間點之間的比較及組內(nèi)不同時間點間的比較采用完全隨機資料的方差分析（one-way ANOVA法），以P＜0.05判斷差異有顯著性。在進(jìn)行方差分析前，首先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗。對方差齊性的資料采用LSD法進(jìn)行多重比較;對方差不齊的資料采用近似F檢驗的Welch法進(jìn)行方差分析，并采用Ta

13、mbane's T2法進(jìn)行多重比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.病理所見:A、E組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔無炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁薄，間質(zhì)血管無擴張，支氣管粘膜上皮完整。B組肺泡結(jié)構(gòu)受到廣泛破壞，肺組織水腫及肺間質(zhì)明顯的增寬，肺泡腔內(nèi)有漿液性滲出，可見大量紅細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞，C組為BMSC高劑量組，大部分肺組織及間質(zhì)結(jié)構(gòu)較完整，小部分肺泡間隔稍增寬，可見肺間質(zhì)水腫減輕，有少量紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤。D組為BMSC低劑量組，肺

14、泡結(jié)構(gòu)部分被破壞，肺間質(zhì)中度的水腫，肺泡腔內(nèi)有多量滲出的紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤。
　　 2.W/D:不同處理組間有顯著差異( F=57.741，P=0.000)，時間因素和分組因素交互效應(yīng)顯著(F=3.129，P=0.004)。B組均明顯高于A組;24h和72h兩個時間點，C、D組低于B組;Pa02比較:B組明顯低于A組，C組三個時間點與B組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.MDA:不同處理組間有顯著差異(F=25.7

15、42，P=0.000)，時間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)( F=0.690，P=0.699)。三個時間點B組MDA明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D組明顯低于B，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;A組和E組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SOD:不同處理組間有顯著差異(F=138.052，P=0.000)，時間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=0.910，P=0.513)。三個時間點B組低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D組明顯高于B，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;E組和A組

16、差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MPO:不同處理組間有顯著差異(F=52.057，P=0.000)，時間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=1.096，P=0.376)。三個時間點B組明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;C、D組明顯低于B，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;A組和E組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TNF-α和IL-1β:IL-1β不同處理組間有顯著差異(F=151.807，P=0.000)，時間因素和分組因素交互效應(yīng)顯著(F=2.085，P=0.048)。TNF-α不

17、同處理組間有顯著差異（F=134.814，P=0.000），時間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=1.394，P=0.213)。TNF-α和IL-1β不同組之間存在顯著差異(F=123.507，P＜0.001)各組同一時間點的比較:B組較A組顯著性升高，P＜0.05;C、D組低于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;E組與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.間充質(zhì)干細(xì)胞移植對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠具有肺保護(hù)作用。

18、　　 2.間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以降低急性肺損傷大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子的表達(dá)。
　　 3.SD大鼠對小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞移植無明顯的排異反應(yīng)，無明顯的毒副作用。
　　 第三章間充質(zhì)干細(xì)胞對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠保護(hù)作用的機制研究
　　 目的:
　　 1.觀察NF-κB在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織的活性變化及間充質(zhì)干細(xì)胞對NF-κB活性的影響，探索NF-κB在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的發(fā)病機理及間充質(zhì)干

19、細(xì)胞治療機理中的作用。
　　 2.觀察CyPA在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織表達(dá)的變化及間充質(zhì)干細(xì)胞對CyPA表達(dá)的影響，探索CyPA在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷的發(fā)病機理及間充質(zhì)干細(xì)胞治療機理中的作用。
　　 方法:
　　 1.間充質(zhì)干細(xì)胞的制備:同第一部分。
　　 2.肺組織NF-κB及CyPA的Western blot:
　　 a、配制SDS-PSGE電泳膠。
　　 b、處理樣品:依次取

20、樣(上樣量為10ug)加入到20ul2×SDS凝膠加樣緩沖液中，沸水中煮沸8分鐘使蛋白變性，然后10000rpm離心5分鐘。
　　 c、上樣:先將梳子小心的移出，把凝膠固定在電泳裝置上，內(nèi)外槽各加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，取樣品用加樣器向孔內(nèi)加入樣品，加樣量通常在10-20ul，將電泳裝置與電源連接，接通電源凝膠上膠電壓為60伏，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后（跑平即可），把電壓提高到120伏。繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上

21、方約0.5cm，然后關(guān)閉電源，從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板，在凝膠上部一角處切去一角標(biāo)注加樣順序。
　　 d、免疫印跡( Western Blot):將電泳結(jié)束后的膠片放入轉(zhuǎn)印緩沖液中，將轉(zhuǎn)印膜也放入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸潤，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，膜在正極，膠在負(fù)極，分別用濾紙3張/面壓住膠和膜。轉(zhuǎn)移時電壓100伏，轉(zhuǎn)移時間1小時，電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，固應(yīng)在轉(zhuǎn)移裝置的外面加入冰塊進(jìn)行除熱，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，卸下電泳裝置，把硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜放入盛有

22、10％脫脂奶粉或10％BSA的封閉液中，封閉2小時或過夜，封閉完畢后用PBST洗膜5次，每次間隔5分鐘，加一抗。反應(yīng)1小時，洗膜5次每次間隔5分鐘。（一抗HPS701:200）(一抗HSV11:200)，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，按說明書要求的稀釋比例加入，反應(yīng)1小時。洗膜5次每次間隔5分鐘。（二抗1:1000），取ECL熒光底物(Pierce公司，貨號:37071)A液和B液1各mL，混勻后，將PVDF膜浸泡其中，室溫孵育3-5分鐘后

23、，用濾紙將PVDF膜表面液體擦干，并將其置于暗室，取醫(yī)用X光底片覆蓋，曝光1分鐘后，依次顯影、定影即可。
　　 3.CyPA的RNA提取和Real-PCR:
　　 a、抽提RNA。
　　 b、反轉(zhuǎn)錄:融解反應(yīng)所需的試劑，上下輕微顛倒混勻，進(jìn)行短暫離心后放置冰上待用，然后配制RT反應(yīng)液（所有反應(yīng)都在冰上進(jìn)行操作），混勻反應(yīng)Mix，短暫離心后37℃孵育30小時，反應(yīng)結(jié)束后，85℃滅活處理5min，對所得到的cDNA用

24、滅菌水稀釋5倍后做好標(biāo)記并-20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
　　 c、定量PCR實驗:通過引物驗證預(yù)實驗確定選取特異性擴增，無引物二聚體、靈敏度高的引物為下游各基因表達(dá)量差異分析的使用引物，將All-in-One qPCRMix在室溫下融解，輕柔得上下顛倒混勻并進(jìn)行短暫離心，同時在使用過程中始終保持避光，制備PCR reaction mix(在冰上操作)，PCR reaction mix制備后，迅速將稍混勻，并加入96孔板中。
　

25、　 4.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0軟件包處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同處理組間資料均數(shù)比較采用析因設(shè)計資料的方差分析。各組間同一時間點之間的比較及組內(nèi)不同時間點間的比較采用完全隨機資料的方差分析（one-way ANOVA法），以P＜0.05判斷差異有顯著性。在進(jìn)行方差分析前，首先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗。對方差齊性的資料采用LSD法進(jìn)行多重比較;對方差不齊的資料采用近似F檢驗的Welch法進(jìn)行方差分析，并采用Tam

26、bane's T2法進(jìn)行多重比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.本研究通過檢測核提取物中NF-κB p65的蛋白表達(dá)量來決定NF-κB的活性。不同處理組間有顯著差異(F=681.495，P=0.000)，時間因素和分組因素交互效應(yīng)顯著( F=8.672，P=0.000)。各組NF-κB方差齊性檢驗:F=1.769，P=0.150，方差齊性。各組之間多重比較選用LSD法。方差分析(ANOVA)結(jié)果:F=185.399 P=0.

27、000，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組同一時間點的比較:三組NF-κB的核內(nèi)表達(dá)量各個時間點之間均有顯著性差異（6小時:F=273.165，P＜0.001;24小時:F=179.975，P＜0.001;72小時:F=254.031，P＜0.001=，以B組最、高C組其次、A組最低，且同一時間點各組之間兩兩比較也均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 2.肺組織CyPA蛋白表達(dá)(Western blot)水平的變化:不同處理組間有顯著

28、差異(F=984.853，P=0.000)，時間因素和分組因素交互效應(yīng)顯著(F=16.884，P=0.000)。各組CyPA方差齊性檢驗:F=1.865，P=0.130，方差齊性。各組之間多重比較選用LSD法。方差分析(ANOVA)結(jié)果:F=278.073 P=0.000，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組同一時間點的方差分析:三組CyPA的表達(dá)量各個時間點之間均有顯著性差異(6小時:F=278.01，P＜0.001;24小時:F=436.92

29、3，P＜0.001;72小時:F=412.712，P＜0.001)，以B組最、高C組其次、A組最低，且同一時間點各組之間兩兩比較也均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 3.肺組織CyPAmRNA轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)水平的變化:不同處理組間有顯著差異(F=53.680，P=0.000)，時間因素和分組因素?zé)o顯著交互效應(yīng)(F=0.015，P=1.000)。各組CyPA方差齊性檢驗:F=2.199，P=0.046，方差不齊。各組之間

30、多重比較選用Tambane's T2法。方差分析選用近似F檢驗的Welch法，方差分析結(jié)果:F=11.964 P=0.000，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組同一時間點的兩兩比較:三組CyPA轉(zhuǎn)錄水平各個時間點之間均有顯著性差異(6小時:F=18.445，P＜0.001;24小時:F=15.117，P＜0.001;72小時:F=20.820，P＜0.001)，以B組最、高C組其次、A組最低，且同一時間點各組之間兩兩比較也均有顯著性差異(P＜0