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文檔簡介
1、急性胰腺炎是常見急腹癥之一,其中約10-20%的患者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎(SevereAcute Pancreatitis,SAP)。SAP發(fā)病兇險(xiǎn),預(yù)后差,臨床死亡率高。目前,臨床上對(duì)SAP的治療仍以抑制胰酶分泌和合成,預(yù)防性應(yīng)用抗生素和營養(yǎng)支持等保守治療為主,缺乏特異有效的治療方法。據(jù)報(bào)道,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymalStem Cells,MSCs)參與了急性胰腺炎的發(fā)病過程,動(dòng)員MSCs可減輕SAP病情,改善其預(yù)后。
2、本課題以SAP大鼠模型為研究對(duì)象,給予SAP雌性模型大鼠輸注同種屬雄性來源的MSCs,觀察移植后SAP大鼠胰腺的病理損傷修復(fù)情況,明確同種異體來源的MSCs能否在SAP病理狀態(tài)下遷移至損傷的胰腺組織,及不同微環(huán)境對(duì)MSCs遷移、分化的影響,初步探討MSCs對(duì)SAP大鼠胰腺損傷修復(fù)的機(jī)制。
一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)
目的:建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代及傳代的培養(yǎng)方法,通過培養(yǎng)傳代,擴(kuò)增出足量的骨髓間充質(zhì)
3、干細(xì)胞,為以后的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
方法:在無菌條件下剪去大鼠雙下肢,分離股骨,于超凈臺(tái)上剪開骨端,用10%胎牛反復(fù)沖洗髓腔直至骨干發(fā)白,1000rpm離心5分鐘,棄上清,按5×105/cm2密度接種于含10%胎牛的DMEM+F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24h內(nèi)觀察細(xì)胞的貼壁情況,此后,每12h觀察細(xì)胞貼壁情況,待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶面積80%時(shí)傳代。首次傳代后繼續(xù)定期觀察、傳代。傳至第三代(P3)時(shí),胰酶消化,收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)。進(jìn)行流式檢測
4、及細(xì)胞活力測定。
結(jié)果:約24h后MSCs開始貼壁,貼壁后MSCs呈紡錘形及三角形等形態(tài),并趨向集落樣生長。經(jīng)傳代培養(yǎng)后,細(xì)胞成份逐漸得到純化,至P3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)單一,MSCs占90%以上。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,代表MSCs的CD29+CD44+CD45-細(xì)胞群,經(jīng)過傳代培養(yǎng),其所占比例逐漸增大,細(xì)胞群的組成逐漸趨于單一,至P3代時(shí),CD29+CD44+CD45-細(xì)胞群達(dá)到95%以上。培養(yǎng)至P3代時(shí)細(xì)胞活力最好,約為96%
5、,P4代后活力逐漸下降。
結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的MSCs原代和傳代培養(yǎng)方法。獲得的MSCs經(jīng)貼壁傳代培養(yǎng),純度達(dá)95%以上,流式鑒定結(jié)果顯示為CD29+CD44+CD45-細(xì)胞群。這為下部分實(shí)驗(yàn)提供了充足的MSCs產(chǎn)品。
二、重癥急性胰腺炎大鼠模型的建立
目的:制作SAP動(dòng)物模型,為研究胰腺損傷修復(fù)提供簡便、可靠、重復(fù)性及可比性均較好的模型,了解大鼠SAP模型的病程規(guī)律,并為下一步實(shí)驗(yàn)提供
6、關(guān)鍵的時(shí)間點(diǎn)。
方法:雌性SD大鼠46只,體重250-300g,隨機(jī)分為2組:正常對(duì)照組(CON組,n=6);SAP造模組(SAP組,n=30)。SAP組分為4h、12h、24h、48h、72h5個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有6只大鼠。CON組大鼠3只不做任何操作處理,3只腹腔注射生理鹽水2次。另取大鼠10只,均SAP造模,觀察72h死亡率。造模前12h起禁食,自由飲水,將L-精氨酸溶于9g/L生理鹽水中配制成濃度為20g/L的L
7、-精氨酸溶液,調(diào)整pH值至7.0左右,2次腹腔注射(2.5g/kg體質(zhì)量),中間間隔1h。在造模后4h、12h、24h、48h、72h處死動(dòng)物,檢測血清淀粉酶,獲取胰腺、肺等組織,固定、石蠟包、切片、H&E染色,依據(jù)schmidt及Mayer評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。并觀察三組動(dòng)物72h的存活情況。
結(jié)果:造模后血清淀粉酶水平4h(4684±1844.4U/L)、12h(6940±1451.5U/L)、24h(9981±2901.6
8、U/L)、48h(3431±1368.5U/L)、72h(1498±1865.9U/L)均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。其中造模后24h組血清淀粉酶水平顯著高于其他各組(P<0.05)。連續(xù)觀察72h以上,正常組大鼠死亡率為0,SAP組大鼠死亡率為40%。顯微鏡下觀察正常對(duì)照組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰,腺泡小葉完整,間質(zhì)無滲出。SAP組造模后4h即可見胰腺間質(zhì)水腫,大量炎細(xì)胞浸潤。12h胰腺腺泡細(xì)胞壞死。24h可觀察到胰腺組織大片壞死,出
9、血及明顯炎細(xì)胞浸潤。48h壞死加重,腺泡小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,可見皂化斑。72h胰腺組織壞死到達(dá)最高程度。胰腺病理評(píng)分顯示,造模后4h起,胰腺病理評(píng)分即顯著升高,至造模后72h胰腺病理評(píng)分達(dá)到高峰。
結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制出L-精氨酸誘導(dǎo)的大鼠SAP模型,該模型制作方法簡單,價(jià)廉,不需特殊材料及設(shè)備,可重復(fù)性好,損傷小,病變程度在不同的胰腺部位比較均勻一致,克服了其他模型需行剖腹術(shù)等缺點(diǎn),大大減少了外源性細(xì)菌污染的機(jī)會(huì),且與
10、人類SAP的病程及組織學(xué)改變相似。是研究急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制及防治措施較為理想、值得推廣的動(dòng)物模型。并且發(fā)現(xiàn),SAP24h時(shí)模型動(dòng)物的胰腺病理損害最為嚴(yán)重,死亡率達(dá)高峰,因此,在后部分的實(shí)驗(yàn)中,我們選擇24h為SAP模型的主要觀測時(shí)間點(diǎn)和干預(yù)治療時(shí)間點(diǎn)。
三、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)實(shí)驗(yàn)性重癥急性胰腺炎的病情減輕作用
目的:明確同種異體來源的骨髓MSCs能否減輕SAP大鼠病情,能否對(duì)大鼠損傷胰腺發(fā)揮保護(hù)或
11、修復(fù)作用。
方法:將SD大鼠隨機(jī)分為2組:SAP+MSCs移植組(n=20):SAP大鼠接受同種異體MSCs移植治療;SAP+培養(yǎng)基輸注組(n=20):SAP大鼠接受等體積培養(yǎng)液。MSCs傳代培養(yǎng)方法同第一部分。SAP動(dòng)物模型制作方法同第二部分。MSCs移植組于SAP造模后24h輸注P3代以上MSCs,約5-7×107/只。培養(yǎng)基輸注組則于SAP造模后24h輸注等體積培養(yǎng)液,2組大鼠均于輸注后24h處死其中10只大鼠,抽取
12、心尖血,測血清淀粉酶值,獲取胰腺組織,一部分用于抽提RNA行RT-PCR檢測TNF-a、IL-1β mRNA表達(dá)情況,另一部分組織用于H&E染色,并行胰腺病理評(píng)分。剩余10只大鼠用于觀察72h存活情況。
結(jié)果:SAP+MSCs移植組大鼠的胰腺病理評(píng)分顯著低于SAP+MSCs移植組(P<0.05)。兩組大鼠的血清淀粉酶水平差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但各時(shí)間點(diǎn)SAP+MSCs移植組血清淀粉酶水平相對(duì)較低。MSCs移植輸注組胰腺組織
13、TNF-a,IL-1β mRNA表達(dá)顯著低于SAP+培養(yǎng)基輸注組(P<0.05)。MSCs移植組大鼠的72h生存率顯著高于培養(yǎng)基輸注組。
結(jié)論:MSCs移植治療可以降低SAP模型大鼠胰腺TNF-a,IL-1β mRNA的表達(dá)水平,減輕SAP大鼠胰腺病理損傷,改善SAP病情,提高SAP大鼠的存活率。
四、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向重癥急性胰腺炎大鼠胰腺的遷移和分化
目的:觀察同種異體MSCs在正常
14、大鼠與SAP大鼠胰腺組織中的遷移、分化情況,了解不同微環(huán)境對(duì)MSCs遷移、分化的影響,初步探討MSCs對(duì)SAP大鼠胰腺損傷修復(fù)的機(jī)制。
方法:將雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組:正常+MSCs移植組(n=10):正常大鼠接受同種異體MSCs移植輸注;SAP+MSCs移植組(n=10):SAP大鼠接受同種異體MSCs移植治療;SAP+培養(yǎng)基輸注組(n=10):SAP大鼠輸注等體積培養(yǎng)液。MSCs取自雄性SD大鼠,其傳代培養(yǎng)方法同第一
15、部分,傳至第三代后,經(jīng)DAPI標(biāo)記染色。SAP動(dòng)物模型制作方法同第二部分,為雌性SD大鼠。MSCs及培養(yǎng)基移植輸注方法同第三部分。三組大鼠均于移植輸注后72h處死大鼠,獲取胰腺組織標(biāo)本,病理評(píng)分胰腺炎癥損傷程度,采用原位雜交(Chromogenic in situ Hybridization,CISH)的方法追蹤MSCs遷移、運(yùn)動(dòng)的軌跡,并將原位雜交與CK19及a-淀粉酶免疫組化染色共定位。
結(jié)果:移植入的MSCs可以遷移
16、至受體大鼠各臟器。且無論是正常胰腺還是SAP受損胰腺,MSCs均能遷移至胰腺組織中,但不同的微環(huán)境對(duì)MSCs的招募能力不同,正常+MSCs移植組中遷移入的MSCs呈散在分布于腺泡細(xì)胞、胰島、胰管及血管上皮細(xì)胞中,SAP+MSCs移植組中遷移入的MSCs多集中分布在某些腺泡細(xì)胞、胰島細(xì)胞或胰管上皮細(xì)胞中,我們還發(fā)現(xiàn)無Y染色體陽性顯色的胰腺組織損傷較嚴(yán)重,腺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯,有較多壞死組織及炎細(xì)胞浸潤,而Y染色體陽性顯色部位,腺泡結(jié)構(gòu)較為完整
17、。并經(jīng)免疫組化染色證實(shí)遷移入的MSCs能分化為表達(dá)CK19的胰腺干細(xì)胞、胰管上皮或胰島細(xì)胞及表達(dá)a-淀粉酶的胰腺腺泡細(xì)胞。
結(jié)論:炎性損傷的胰腺組織具有招募MSCs的能力,MSCs能定向遷徙和分化為部分胰腺組織細(xì)胞,并能減輕大鼠胰腺局部的炎癥反應(yīng)。
全文小結(jié)
本課題采用L-精氨酸2次腹腔注射法成功誘導(dǎo)SAP大鼠模型,通過對(duì)SAP病情指標(biāo)的評(píng)估,確定24h為MSCs移植時(shí)間點(diǎn)。采用貼壁法,對(duì)MSC
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