骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠損傷胰腺的組織修復(fù)作用.pdf

1、急性胰腺炎是常見急腹癥之一，其中約10-20％的患者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎(SevereAcute Pancreatitis，SAP)。SAP發(fā)病兇險(xiǎn)，預(yù)后差，臨床死亡率高。目前，臨床上對(duì)SAP的治療仍以抑制胰酶分泌和合成，預(yù)防性應(yīng)用抗生素和營養(yǎng)支持等保守治療為主，缺乏特異有效的治療方法。據(jù)報(bào)道，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymalStem Cells，MSCs)參與了急性胰腺炎的發(fā)病過程，動(dòng)員MSCs可減輕SAP病情，改善其預(yù)后。

2、本課題以SAP大鼠模型為研究對(duì)象，給予SAP雌性模型大鼠輸注同種屬雄性來源的MSCs，觀察移植后SAP大鼠胰腺的病理損傷修復(fù)情況，明確同種異體來源的MSCs能否在SAP病理狀態(tài)下遷移至損傷的胰腺組織，及不同微環(huán)境對(duì)MSCs遷移、分化的影響，初步探討MSCs對(duì)SAP大鼠胰腺損傷修復(fù)的機(jī)制。
　　 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)
　　 目的：建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代及傳代的培養(yǎng)方法，通過培養(yǎng)傳代，擴(kuò)增出足量的骨髓間充質(zhì)

3、干細(xì)胞，為以后的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 方法：在無菌條件下剪去大鼠雙下肢，分離股骨，于超凈臺(tái)上剪開骨端，用10％胎牛反復(fù)沖洗髓腔直至骨干發(fā)白，1000rpm離心5分鐘，棄上清，按5×105/cm2密度接種于含10％胎牛的DMEM+F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24h內(nèi)觀察細(xì)胞的貼壁情況，此后，每12h觀察細(xì)胞貼壁情況，待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶面積80％時(shí)傳代。首次傳代后繼續(xù)定期觀察、傳代。傳至第三代(P3)時(shí)，胰酶消化，收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)。進(jìn)行流式檢測

4、及細(xì)胞活力測定。
　　 結(jié)果：約24h后MSCs開始貼壁，貼壁后MSCs呈紡錘形及三角形等形態(tài)，并趨向集落樣生長。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞成份逐漸得到純化，至P3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)單一，MSCs占90％以上。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，代表MSCs的CD29+CD44+CD45-細(xì)胞群，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，其所占比例逐漸增大，細(xì)胞群的組成逐漸趨于單一，至P3代時(shí)，CD29+CD44+CD45-細(xì)胞群達(dá)到95％以上。培養(yǎng)至P3代時(shí)細(xì)胞活力最好，約為96％

5、，P4代后活力逐漸下降。
　　 結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的MSCs原代和傳代培養(yǎng)方法。獲得的MSCs經(jīng)貼壁傳代培養(yǎng)，純度達(dá)95％以上，流式鑒定結(jié)果顯示為CD29+CD44+CD45-細(xì)胞群。這為下部分實(shí)驗(yàn)提供了充足的MSCs產(chǎn)品。
　　 二、重癥急性胰腺炎大鼠模型的建立
　　 目的：制作SAP動(dòng)物模型，為研究胰腺損傷修復(fù)提供簡便、可靠、重復(fù)性及可比性均較好的模型，了解大鼠SAP模型的病程規(guī)律，并為下一步實(shí)驗(yàn)提供

6、關(guān)鍵的時(shí)間點(diǎn)。
　　 方法：雌性SD大鼠46只，體重250-300g，隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組(CON組，n=6)；SAP造模組(SAP組，n=30)。SAP組分為4h、12h、24h、48h、72h5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有6只大鼠。CON組大鼠3只不做任何操作處理，3只腹腔注射生理鹽水2次。另取大鼠10只，均SAP造模，觀察72h死亡率。造模前12h起禁食，自由飲水，將L-精氨酸溶于9g/L生理鹽水中配制成濃度為20g/L的L

7、-精氨酸溶液，調(diào)整pH值至7.0左右，2次腹腔注射(2.5g/kg體質(zhì)量)，中間間隔1h。在造模后4h、12h、24h、48h、72h處死動(dòng)物，檢測血清淀粉酶，獲取胰腺、肺等組織，固定、石蠟包、切片、H&E染色，依據(jù)schmidt及Mayer評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。并觀察三組動(dòng)物72h的存活情況。
　　 結(jié)果：造模后血清淀粉酶水平4h(4684±1844.4U/L)、12h(6940±1451.5U/L)、24h(9981±2901.6

8、U/L)、48h(3431±1368.5U/L)、72h(1498±1865.9U/L)均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。其中造模后24h組血清淀粉酶水平顯著高于其他各組(P＜0.05)。連續(xù)觀察72h以上，正常組大鼠死亡率為0，SAP組大鼠死亡率為40％。顯微鏡下觀察正常對(duì)照組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整，間質(zhì)無滲出。SAP組造模后4h即可見胰腺間質(zhì)水腫，大量炎細(xì)胞浸潤。12h胰腺腺泡細(xì)胞壞死。24h可觀察到胰腺組織大片壞死，出

9、血及明顯炎細(xì)胞浸潤。48h壞死加重，腺泡小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，可見皂化斑。72h胰腺組織壞死到達(dá)最高程度。胰腺病理評(píng)分顯示，造模后4h起，胰腺病理評(píng)分即顯著升高，至造模后72h胰腺病理評(píng)分達(dá)到高峰。
　　 結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制出L-精氨酸誘導(dǎo)的大鼠SAP模型，該模型制作方法簡單，價(jià)廉，不需特殊材料及設(shè)備，可重復(fù)性好，損傷小，病變程度在不同的胰腺部位比較均勻一致，克服了其他模型需行剖腹術(shù)等缺點(diǎn)，大大減少了外源性細(xì)菌污染的機(jī)會(huì)，且與

10、人類SAP的病程及組織學(xué)改變相似。是研究急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制及防治措施較為理想、值得推廣的動(dòng)物模型。并且發(fā)現(xiàn)，SAP24h時(shí)模型動(dòng)物的胰腺病理損害最為嚴(yán)重，死亡率達(dá)高峰，因此，在后部分的實(shí)驗(yàn)中，我們選擇24h為SAP模型的主要觀測時(shí)間點(diǎn)和干預(yù)治療時(shí)間點(diǎn)。
　　 三、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)實(shí)驗(yàn)性重癥急性胰腺炎的病情減輕作用
　　 目的：明確同種異體來源的骨髓MSCs能否減輕SAP大鼠病情，能否對(duì)大鼠損傷胰腺發(fā)揮保護(hù)或

11、修復(fù)作用。
　　 方法：將SD大鼠隨機(jī)分為2組：SAP+MSCs移植組(n=20)：SAP大鼠接受同種異體MSCs移植治療；SAP+培養(yǎng)基輸注組(n=20)：SAP大鼠接受等體積培養(yǎng)液。MSCs傳代培養(yǎng)方法同第一部分。SAP動(dòng)物模型制作方法同第二部分。MSCs移植組于SAP造模后24h輸注P3代以上MSCs，約5-7×107/只。培養(yǎng)基輸注組則于SAP造模后24h輸注等體積培養(yǎng)液，2組大鼠均于輸注后24h處死其中10只大鼠，抽取

12、心尖血，測血清淀粉酶值，獲取胰腺組織，一部分用于抽提RNA行RT-PCR檢測TNF-a、IL-1β mRNA表達(dá)情況，另一部分組織用于H&E染色，并行胰腺病理評(píng)分。剩余10只大鼠用于觀察72h存活情況。
　　 結(jié)果：SAP+MSCs移植組大鼠的胰腺病理評(píng)分顯著低于SAP+MSCs移植組(P＜0.05)。兩組大鼠的血清淀粉酶水平差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但各時(shí)間點(diǎn)SAP+MSCs移植組血清淀粉酶水平相對(duì)較低。MSCs移植輸注組胰腺組織

13、TNF-a，IL-1β mRNA表達(dá)顯著低于SAP+培養(yǎng)基輸注組(P＜0.05)。MSCs移植組大鼠的72h生存率顯著高于培養(yǎng)基輸注組。
　　 結(jié)論：MSCs移植治療可以降低SAP模型大鼠胰腺TNF-a，IL-1β mRNA的表達(dá)水平，減輕SAP大鼠胰腺病理損傷，改善SAP病情，提高SAP大鼠的存活率。
　　 四、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向重癥急性胰腺炎大鼠胰腺的遷移和分化
　　 目的：觀察同種異體MSCs在正常

14、大鼠與SAP大鼠胰腺組織中的遷移、分化情況，了解不同微環(huán)境對(duì)MSCs遷移、分化的影響，初步探討MSCs對(duì)SAP大鼠胰腺損傷修復(fù)的機(jī)制。
　　 方法：將雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常+MSCs移植組(n=10)：正常大鼠接受同種異體MSCs移植輸注；SAP+MSCs移植組(n=10)：SAP大鼠接受同種異體MSCs移植治療；SAP+培養(yǎng)基輸注組(n=10)：SAP大鼠輸注等體積培養(yǎng)液。MSCs取自雄性SD大鼠，其傳代培養(yǎng)方法同第一

15、部分，傳至第三代后，經(jīng)DAPI標(biāo)記染色。SAP動(dòng)物模型制作方法同第二部分，為雌性SD大鼠。MSCs及培養(yǎng)基移植輸注方法同第三部分。三組大鼠均于移植輸注后72h處死大鼠，獲取胰腺組織標(biāo)本，病理評(píng)分胰腺炎癥損傷程度，采用原位雜交(Chromogenic in situ Hybridization，CISH)的方法追蹤MSCs遷移、運(yùn)動(dòng)的軌跡，并將原位雜交與CK19及a-淀粉酶免疫組化染色共定位。
　　 結(jié)果：移植入的MSCs可以遷移

16、至受體大鼠各臟器。且無論是正常胰腺還是SAP受損胰腺，MSCs均能遷移至胰腺組織中，但不同的微環(huán)境對(duì)MSCs的招募能力不同，正常+MSCs移植組中遷移入的MSCs呈散在分布于腺泡細(xì)胞、胰島、胰管及血管上皮細(xì)胞中，SAP+MSCs移植組中遷移入的MSCs多集中分布在某些腺泡細(xì)胞、胰島細(xì)胞或胰管上皮細(xì)胞中，我們還發(fā)現(xiàn)無Y染色體陽性顯色的胰腺組織損傷較嚴(yán)重，腺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，有較多壞死組織及炎細(xì)胞浸潤，而Y染色體陽性顯色部位，腺泡結(jié)構(gòu)較為完整

17、。并經(jīng)免疫組化染色證實(shí)遷移入的MSCs能分化為表達(dá)CK19的胰腺干細(xì)胞、胰管上皮或胰島細(xì)胞及表達(dá)a-淀粉酶的胰腺腺泡細(xì)胞。
　　 結(jié)論：炎性損傷的胰腺組織具有招募MSCs的能力，MSCs能定向遷徙和分化為部分胰腺組織細(xì)胞，并能減輕大鼠胰腺局部的炎癥反應(yīng)。
　　 全文小結(jié)
　　 本課題采用L-精氨酸2次腹腔注射法成功誘導(dǎo)SAP大鼠模型，通過對(duì)SAP病情指標(biāo)的評(píng)估，確定24h為MSCs移植時(shí)間點(diǎn)。采用貼壁法，對(duì)MSC