棉花離體培養(yǎng)再生體系的研究及抗黃萎病轉基因棉花植株的培育.pdf

1、細胞工程和基因工程的迅速發(fā)展和廣泛應用為植物的遺傳改良開拓了廣闊的前景。植物抗病基因工程是植物基因工程的一個分支，它是將外源抗病基因通過各種遺傳方法導入到植物基因組中并培育抗病品種。棉花是我國第一大經濟作物，棉花黃萎病被稱為棉花的“癌癥”，本研究以湖南重要的優(yōu)良品種湘棉10號、湘棉15號為研究材料，采用花粉管通道法將溶菌酶基因導入兩品種均獲得了抗黃萎病的棉花植株，同時進行了湘棉10號離體培養(yǎng)再生體系建立的研究為農桿菌介導轉化外源基因奠定

2、了基礎。研究結果如下： 1. 湘棉10號再生體系建立的研究 (1)外植體類型是影響棉花愈傷組織誘導的重要因素。不同外植體在相同激素組合下，愈傷誘導率不同。湘棉10號的愈傷組織誘導率大小順序為下胚軸>子葉>胚根。 (2)以下胚軸為外植體，通過愈傷組織的誘導、繼代和分化，摸索出愈傷組織的誘導、繼代和分化的最適基本培養(yǎng)基是MSB：愈傷組織的誘導、繼代和分化的最適碳源是葡萄糖：最適誘導、繼代和分化培養(yǎng)基為MSB+ZT0.

3、1mg/L：不同培養(yǎng)基和激素配比的成苗率不同，SH+IAAO.2mg/L+KT0.2mg/L成苗率最高達13.6％：生根的最適培養(yǎng)基是Ms+Ihh0.1mg/L，生根率高達100％。 (3)愈傷組織的誘導和繼代表明，愈傷組織形成的快慢、多少與激素、外植體種類、溫度和基因型有關。2，4-D的添加有利于愈傷組織的誘導和形成但未能直接誘導獲得胚性愈傷組織，ZT的單獨使用則可直接誘導獲得少量的胚性愈傷組織；同時研究表明溫度影響愈傷組織的

4、誘導，最適溫度為28℃左右。 (4)在防褐的研究中發(fā)現對基本培養(yǎng)基的改良，選擇適宜的激素組合以及添加防褐物質如活性碳，PVP等都對降低愈傷組織的褐化有明顯的作用。KT+6-BA激素組合可以明顯降低褐化，而KT、IAA、6-BA三種激素的單獨應用效果對愈傷組織的褐化改善不明顯。 2. 花粉管通道法獲得轉溶菌酶基因植株 以湘棉10號、湘棉15號為研究材料，采用花粉管通道法將溶菌酶基因導入，在遺傳轉化中，摸索出了該方法

5、轉化的較佳位置是從果枝第2果臺開始至第6果臺，轉化時間應選擇開花約24小時的自交棉花進行注射，其成鈴率較高而且收獲的擬轉化種子數量最多，注射方式以對準中軸胎座的中部位置垂直插入子房最佳，其轉化率達9％而且此種注射方式減少對子房的傷害提高了成鈴率。采用抗生素篩選最后篩選得到23株抗卡那霉素湘棉10號植株和9株抗G418湘棉15號植株。經分子生物學方法PCR，PCR-SOUTHERN檢測，結果發(fā)現：23株抗卡那霉素湘棉10號植株中1株不含選

6、擇標記基因NPTⅡ只含溶菌酶基因，同時獲得4株只含選擇標記基因不含溶菌酶基因植株，證實其他18株轉溶菌酶基因棉花中溶菌酶基因和選擇標記基因NPTⅡ均已整合在棉花基因組中，9株抗G418的湘棉15號植株中2株只含選擇標記基因不含溶菌酶基因植株，證實其他7株轉溶菌酶基因棉花中溶菌酶基因和選擇標記基因NPTⅡ均已整合在棉花基因組中。 3. 轉基因植株初步的抗性測試 采用菌液澆根法和針刺葉片噴灑法兩種方法對轉基因植株進行初步的抗