棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系建立.pdf

1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是棉花遺傳轉(zhuǎn)化的最常用方法。陸地棉常用的受體有下胚軸、子葉、莖尖和棉花的胚性愈傷組織等。以下胚軸為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最成熟的轉(zhuǎn)化體系,但是轉(zhuǎn)化周期較長(zhǎng),至少10-12個(gè)月;農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花胚性愈傷組織,不但可以縮短轉(zhuǎn)化周期,而且能夠降低工作量,最終提高轉(zhuǎn)化效率,但是獲得的轉(zhuǎn)基因苗會(huì)出現(xiàn)高頻的變異;以莖尖作為受體的轉(zhuǎn)化體系屬于器官發(fā)生的再生過(guò)程,會(huì)出現(xiàn)嵌合體現(xiàn)象。本研究首先選取新陸早45號(hào)的下胚軸作為外植體,經(jīng)過(guò)愈傷

2、組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織培養(yǎng)、胚狀體形成和小植株的獲得等實(shí)驗(yàn),成功建立了棉花再生體系;在此基礎(chǔ)上選取新陸早33號(hào)的胚性愈傷組織為受體,將SM基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)過(guò)抗性篩選和胚胎發(fā)生,獲得轉(zhuǎn)基因小苗,于溫室嫁接成活;同時(shí),嘗試選成熟胚作為受體,進(jìn)行轉(zhuǎn)化,經(jīng)過(guò)約20-30d的抗性篩選,獲得了轉(zhuǎn)基因小苗,是一種不依賴(lài)于組織培養(yǎng)的一種轉(zhuǎn)化方法。具體的研究結(jié)果如下:
　　1、以傳統(tǒng)再生體系為基礎(chǔ),選取新陸早45號(hào)下胚軸作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),

3、建立了高效的再生體系。(1) MS+0.1 mg.L-12,4-D+0.1 mg.L-1 KT+1.9 g.L-1 KNO3+0.75 g.L-1 MgCl2+30 g.L-1葡萄糖+2.0 g.L-1 Gelrite是適合愈傷組織增值培養(yǎng)基,利用該培養(yǎng)基,愈傷組織的誘導(dǎo)率為88.5％。(2)待愈傷組織增殖到5-7mm時(shí),進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo),約2-3次繼代會(huì)出現(xiàn)胚性愈傷組織,觀察發(fā)現(xiàn)顏色為淺綠、灰綠到黃綠,質(zhì)地疏松的愈傷組織容易分化出

4、胚性愈傷組織,分化率為73%。(3)挑出單個(gè)胚性愈傷組織進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo),進(jìn)一步再生小苗,最終得到了16株再生小苗。整個(gè)周期約5-7個(gè)月。
　　2、在建立上述棉花高效再生體系的基礎(chǔ)上,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將棉花的SM基因轉(zhuǎn)化到新陸早33號(hào)的胚性愈傷組織中,經(jīng)過(guò)抗性篩選、分化培養(yǎng)和胚胎發(fā)生等階段,獲得了10棵轉(zhuǎn)基因小苗。整個(gè)轉(zhuǎn)化周期5-7個(gè)月,提取這些轉(zhuǎn)基因小苗的DNA, PCR檢測(cè)SM基因的陽(yáng)性率是77%。
　　3、在以成熟胚為受

5、體的再生與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,首先從篩選出最合適的品種出發(fā),選用四個(gè)陸地棉的種進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)四個(gè)品種的瞬時(shí)表達(dá)率沒(méi)有差異,但新陸早45號(hào)的轉(zhuǎn)化率比其他三個(gè)品種高出10-20%。同時(shí)對(duì)農(nóng)桿菌菌液的濃度,侵染時(shí)間,卡那霉素篩選濃度,AS和以及表面活性劑有無(wú)等條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明,OD值在0.6,侵染時(shí)間為15min,卡那霉素篩選濃度為100mg/L,侵染時(shí)加入 AS和Silwet-77,轉(zhuǎn)化效率最高,高達(dá)25%。最終得到轉(zhuǎn)基因植株28棵。轉(zhuǎn)