棉花抗黃萎病相關(guān)基因GhLAC的功能分析.pdf

1、細(xì)胞壁是植物抵抗病原菌侵入的重要屏障，也是寄主與病原菌互作的重要場所。寄主植物細(xì)胞通過在細(xì)胞壁、胞間層、細(xì)胞質(zhì)部位產(chǎn)生一系列抗性反應(yīng)，如細(xì)胞壁木質(zhì)化、胼胝質(zhì)積累、伸展蛋白合成等途徑阻止病原菌的再度侵染和蔓延。本研究通過對3個(gè)不同抗病棉花品種Pima90-53，冀棉20和邯208的接菌試驗(yàn)，研究細(xì)胞壁的組分含量和GhLAC的表達(dá)水平變化與棉花黃萎病抗性的關(guān)系;從冀棉20中克隆抗黃萎病相關(guān)基因GhLAC;研究GhLAC的超表達(dá)和基因沉默后，

2、轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的細(xì)胞壁糖組分、木質(zhì)素含量和木質(zhì)素組分含量變化與植物抗病性的關(guān)系。主要結(jié)果如下:
　　1、3個(gè)不同抗病棉花品種Pima90-53，冀棉20和邯208的酸不可溶性木質(zhì)素含量與品種的病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=0.99991*)，與黃萎病抗性呈正相關(guān)。
　　2、克隆獲得漆酶GhLAC基因的ORF（gi: EU642559.1，1701bp）序列和基因組序列(2401bp)。該基因含有6個(gè)內(nèi)含子，在二倍體雷蒙德氏棉的

3、基因組中含有7個(gè)漆酶的同源基因，且均分布與9號染色體。
　　3、GhLAC蛋白屬于銅藍(lán)氧化酶蛋白，定位于細(xì)胞壁。在接種黃萎病菌8h時(shí)，GhLAC在冀棉20中的表達(dá)量達(dá)到最高并在后續(xù)64h內(nèi)一直維持較高水平，且在各檢測時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對照邯208。
　　4、構(gòu)建完成GhLAC的超表達(dá)載體pGNLac、RNAi載體ipCamLac和融合表達(dá)載體pCamLacGFP，并獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥pGNLac純合株系6個(gè)，pCamLacGFP

4、純合株系12個(gè)，ipCamLacGFP純合株系8個(gè)。
　　5、GhLAC VIGS處理后的冀棉20病情指數(shù)為66.99，與空載體對照處理的棉花病情指數(shù)41.97表現(xiàn)為顯著性差異;GhLAC的沉默增加了棉花對V.dahliae的敏感性。
　　6、GhLAC的超表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因株系對黃萎病的抗性，而GhLAC的RNAi降低了植株對黃萎病菌的抗性。接菌黃萎病菌后，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系導(dǎo)管輕微堵塞，RNAi和野生型擬南芥的莖部疏導(dǎo)

5、組織由導(dǎo)管堵塞嚴(yán)重。超表達(dá)株系中的株高、AIL含量、G型木質(zhì)素單體(G-lignin)、S型木質(zhì)素單體(S-lignin)和總木質(zhì)素的含量均顯著或極顯著高于RNAi株系和野生型擬南芥。明確了GhLAC參與了木質(zhì)素的生物合成途徑，GhLAC在受到黃萎病菌侵染的轉(zhuǎn)基因擬南芥中有利于維持G型木質(zhì)素單體(G-lignin)的含量。
　　7、構(gòu)建了雙元表達(dá)載體pCamE(gi: JX841315)。在該載體的啟動子上游、多克隆位點(diǎn)和終止子下