草莓鑲脈病毒移動蛋白P1和森林草莓葉綠素a-b結(jié)合蛋白LHCⅡ互作機制研究.pdf

1、草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）屬于花椰菜花葉病毒屬，本實驗室已證明SVBVP1蛋白是移動蛋白，在病毒的轉(zhuǎn)移和擴散過程中起到關(guān)鍵作用，但P1蛋白如何與植物蛋白互作從而影響病毒的擴散目前還不清楚。本研究構(gòu)建草莓cDNA酵母文庫，以P1蛋白為誘餌從草莓cDNA文庫篩選出與其互作的寄主因子。本研究以P1蛋白為誘餌蛋白篩選感染SVBV森林草莓的酵母cDNA文庫，獲得與其互作的寄主因子葉綠素a/

2、b結(jié)合蛋白LHCⅡ，利用酵母雙雜交實驗(Y2H)、雙分子熒光互補實驗(BiFC)、pull-down實驗、Co-IP實驗驗證P1蛋白和LHCⅡ蛋白互作，借助PVX運動缺陷型載體驗證LHCⅡ蛋白能夠促進P1蛋白協(xié)助病毒的胞間擴散，進一步探明SVBV與森林草莓互作的分子機理提供理論依據(jù)。
　　1.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與SVBV P1蛋白互作的寄主因子
　　pGBK-P1誘餌蛋白質(zhì)粒和森林草莓cDNA文庫共轉(zhuǎn)化酵母菌，涂布到SD

3、/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/-Gluc培養(yǎng)基上，選取長勢良好的藍色酵母斑，提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化，篩選陽性，測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中Blast比對，發(fā)現(xiàn)15種寄主因子中，有3種寄主因子的篩選豐度較高，其中就有葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCⅡ)基因。說明LHCⅡ與P1關(guān)系較為密切，具有較高的研究價值。
　　2.Real-time RT-PCR分析森林草莓LHCⅡ基因的RNA積累水平
　

4、　森林草莓接種SVBV侵染性克隆，提取森林草莓總RNA，內(nèi)參為森林草莓Actin基因，real-time RT-PCR分析森林草莓LHCⅡ基因的mRNA表達水平。實驗表明，感病森林草莓LHCⅡ基因的RNA積累水平上升，達到健康草莓的0.5倍。結(jié)果說明感病森林草莓中LHCⅡ基因能夠大量表達。
　　3.P1和LHCⅡ亞細胞定位及共定位
　　pCAM-P1-GFP和pCAM-LHCⅡ-mCherry分別浸潤本氏煙葉片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融

5、合蛋白P1-GFP主要形成綠色點狀分布在細胞質(zhì)和細胞邊緣，而融合蛋白LHCⅡ-mCherry的紅色熒光主要分布在細胞核和細胞邊緣。pCAM-P1-GFP和pCAM-LHCⅡ-mCherry共浸潤本氏煙葉片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合蛋白P1-GFP綠色點狀和融合蛋白LHCⅡ-mCherry紅色熒光能夠在細胞邊緣重合，說明兩者能夠共定位。
　　4.酵母雙雜(Y2H)驗證P1與LHCⅡ互作
　　pGBK-P1+pGAD-LHCⅡ、pGBK-

6、LHCⅡ+pGAD-P1，分別共轉(zhuǎn)化酵母菌;涂布于SD/-Ade/-His和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/培養(yǎng)基。實驗發(fā)現(xiàn)，BK-P1+AD-LHCⅡ、陽性對照能夠長斑，其他處理組均不能長斑。說明P1和LHCⅡ能夠在體外互作。
　　5.雙分子熒光互補(BiFC)驗證P1與LHCⅡ互作
　　YFPn-P1/YFPc-LHCⅡ、YFPn-LHCⅡ/YFPc-P1，浸潤本氏煙葉片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YFpn-LHCⅡ/YF

7、pc-p1和YFpn--4A+YFPc-P2黃色熒光亮度很強，但YFpn-LHCⅡ/YFPc-P1葉片氣孔也有黃色熒光，YFPn-P1/YFPc-LHCⅡ只在單個細胞內(nèi)有熒光，其他處理組均無黃色熒光。說明P1和LHCⅡ能夠在本氏煙體內(nèi)互作。
　　6.免疫共沉淀(Pull-down)驗證P1與LHCⅡ互作
　　MBP-P1蛋白和LHCⅡ-flag蛋白混合，加入flag珠子，洗脫珠子上結(jié)合的多余蛋白，western blot檢測

8、洗脫的蛋白。
　　實驗結(jié)果表明，當LHCⅡ-flag和MBP-P1兩個融合蛋白混合，檢測flag掛出的蛋白，能夠檢測到MBP-P1蛋白，說明兩者在體外存在互作。其他處理組僅帶有flag標簽的蛋白，而不能檢測到MBP標簽的蛋白，說明它們之間不存在互作。說明P1與LHCⅡ蛋白能夠在體外互作。
　　7.免疫共沉淀(Co-IP)驗證P1與LHCⅡ互作
　　myc-P1和LHCⅡ-flag共浸潤本氏煙。將融合蛋白混合，加入fla

9、g珠子，洗脫珠子上結(jié)合的多余蛋白，western blot檢測洗脫的蛋白。
　　實驗結(jié)果表明，當LHCⅡ-flag和myc-P1兩個融合蛋白混合，檢測flag掛出的蛋白有myc-P1蛋白，說明兩者在體內(nèi)存在互作。其他處理僅帶有flag標簽的蛋白，而不能檢測到myc標簽的蛋白，說明它們之間不存在互作。說明P1與LHCⅡ蛋白能夠在體內(nèi)互作。
　　8.LHCⅡ蛋白的表達能幫助P1蛋白促進病毒局部擴散
　　PVX(ΔP25)-

10、GFP(OD600=0.001),PVX(ΔP25)-GFP(OD600=0.001)/pCAM(OD600=1.0),MMA,PVX(ΔP25)-GFP(OD600=0.001)/P25(OD600=1.0),PVX(ΔP25)-GFP(OD600=0.001)/pCAM-myc-P1(OD600=1.0),PVX(ΔP25)-GFP(OD600=0.001)/pCAM-myc-P1(OD600=1.0)/pCAM-flag-LHCⅡ

11、(OD600=1.0)浸潤本氏煙葉片，共聚焦觀察。
　　實驗結(jié)果表明，PVX(ΔP25)-GFP(OD600=0.001)/PVX(ΔP25)-GFP(OD600=0.001)/pCAM(OD600=1.0)只有單個細胞有綠色熒光，PVX(ΔP25)-GFP(OD600=0.001)/P25(OD600=1.0)許多細胞有綠色熒光，說明P25能回補病毒的移動蛋白功能，PVX(ΔP25)-GFP(OD600=0.001)/pCAM-