草莓鑲脈病毒侵染性克隆鑒定及其反式激活因子功能分析.pdf

1、草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）中國分離物侵染性克隆pSVBV-SY可以侵染森林草莓，但是葉片劃傷接種侵染率較低，阻礙了侵染性克隆的研究。為了改進(jìn)接種方法，本研究利用農(nóng)桿菌真空抽濾法接種草莓，可顯著提高接種效率，pSVBV-SY在森林草莓上實現(xiàn)高效侵染且表現(xiàn)出典型鑲脈癥狀。SVBV病毒載體pSVBV-MCS同法接種森林草莓，可驗證其侵染性。已有研究發(fā)現(xiàn)花椰菜花葉病毒科病毒P6蛋白能夠反

2、式激活多順反子mRNA的翻譯，本研究鑒定SVBV P6蛋白是病毒的翻譯反式激活因子(transactivator)，能夠高效激活人工構(gòu)建雙順反子第2個基因的表達(dá)。預(yù)測反式激活因子P6功能域，構(gòu)建系列P6突變體，發(fā)現(xiàn)P6各突變體均不能反式激活雙順反子第2個基因的表達(dá)。
　　1、SVBV侵染性克隆的侵染性鑒定和檢測
　　比較劃傷接種法和真空抽濾法接種草莓的接種效率，SVBV沈陽分離物侵染性克隆pSVBV-SY接種森林草莓，均接種

3、15株，35d后檢測侵染率，劃傷接種侵染率僅在20％-40％之間，真空抽濾法接種侵染率在86％-100％之間。顯癥植株P(guān)CR均能夠檢測到pSVBV-SY基因組ORFⅣ和ORFⅥ基因。Southern blot（DNA雜交）檢測顯癥森林草莓DNA，進(jìn)一步驗證侵染性克隆pSVBV-SY侵染性，能夠檢測到病毒基因組DNA。結(jié)果表明，侵染性克隆pSVBV-SY具有侵染性，且能夠在森林草莓上出現(xiàn)典型鑲脈癥狀，真空抽濾法接種草莓可以顯著提高病毒侵染

4、性克隆接種效率。
　　2、SVBV病毒載體的侵染性鑒定
　　SVBV美國分離物病毒載體pSVBV-MCS真空抽濾法接種森林草莓，接種后55d，森林草莓系統(tǒng)幼葉表現(xiàn)出典型的鑲脈癥狀。PCR檢測發(fā)現(xiàn)，pSVBV-MCS成功侵染森林草莓。與SVBV美國分離物侵染性克隆pSVBV-US相比，接種pSVBV-MCS病毒載體，侵染率降低，寄主顯癥時間延緩，鑲脈癥狀表型減輕。
　　3、SVBV侵染性克隆能夠反式激活雙順反子表達(dá)

5、>　　克隆CaMV、SVBV-US和SVBV-SY完整ORFⅦ基因和ORFⅠ基因5'端51nts片段，分別插入載體pCAM-GFP，構(gòu)建含有雙順反子的表達(dá)載體p35S-Ca71GFP、pUSFlt-US71GFP和pSYFlt-SY71GFP，第1個順反子是完整ORFⅦ基因，第2個順反子是ORFⅠ基因5'端51nts與綠色熒光蛋白報告基因（gfp）形成的融合基因。SVBV美國分離物侵染性克隆pSVBV-US和pCAM-2b與雙順反子p3

6、5S-Ca71GFP共浸潤本氏煙，結(jié)果表明病毒侵染性克隆能夠反式激活雙順反子表達(dá)。
　　4、SVBV病毒反式激活因子的鑒定
　　為了鑒定SVBV反式激活作用的功能蛋白，構(gòu)建含有SVBV美國分離物6個ORF的表達(dá)載體，pCAM-USP1、pCAM-USP2、pCAM-USP3、pCAM-USP4、pCAM-USP5和pCAM-USP6，分別與雙順反子p35S-Ca71GFP共浸潤本氏煙，只有pCAM-USP6能夠反式激活雙順反

7、子表達(dá)，其余ORF均不具有反式激活功能。實驗表明P6蛋白即為SVBV的反式激活因子，協(xié)助病毒mRNA的翻譯。
　　pCAM-USP6分別與p35S-Ca71GFP、pUSFlt-US71GFP和pSYFlt-SY71GFP3種雙順反子共浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)pCAM-USP6能夠反式激活3種雙順反子表達(dá)。同理，利用SVBV沈陽分離物pCAM-SYP6與3種雙順反子共浸潤本氏煙得到了同樣的結(jié)果，pCAM-SYP6也能夠反式激活3種雙順反子

8、表達(dá)。進(jìn)一步證明P6蛋白的反式激活功能，SVBV不同分離物P6蛋白均可以反式激活雙順反子表達(dá)。
　　5、P6蛋白反式激活核心功能域的探究
　　為了探究P6蛋白反式激活核心功能域，根據(jù)P6蛋白的三維結(jié)構(gòu)以及P6的核定位信號預(yù)測其功能域，構(gòu)建P6的系列突變體pCAM-P6(1-300)、pCAM-P6(301-515)、pCAM-P6(1-113)、pCAM-P6(114-429)、pCAM-P6(430-515)、pCAM-P