草莓鑲脈病毒(SVBV)啟動(dòng)子的鑒定.pdf

1、啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，它能夠啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。本研究克隆了中國(guó)草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）全長(zhǎng)啟動(dòng)子以及該啟動(dòng)子的缺失突變體。構(gòu)建系列啟動(dòng)子植物表達(dá)載體，利用gus與gfp 兩種報(bào)告基因鑒定了SVBV 啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)強(qiáng)度和表達(dá)類型。結(jié)果表明，SVBV 全長(zhǎng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性高于對(duì)照花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S啟動(dòng)子。本研

2、究鑒定了一個(gè)新的植物病毒啟動(dòng)子，將為植物基因工程提供一種新的工具。
　　 1．SVBV 全長(zhǎng)啟動(dòng)子及其缺失突變體的克隆與植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 設(shè)計(jì)特異性引物分別擴(kuò)增SVBV 全長(zhǎng)啟動(dòng)子及其2個(gè)缺失突變體序列，克隆并測(cè)序，SVBV 全長(zhǎng)啟動(dòng)子（SVBV P1）序列長(zhǎng)度為984 bp，2個(gè)缺失突變體為核心啟動(dòng)子（SVBV P2）和缺失上游調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子（SVBV P3），長(zhǎng)度為324bp和819 bp。
　　 將S

3、VBV P1、SVBV P2和SVBV P3分別與pINT121 載體gus基因前的35S啟動(dòng)子置換，獲得植物表達(dá)載體pINT P1、pINT P2和pINT P3。再將SVBV P1和美國(guó)SVBV 全長(zhǎng)啟動(dòng)子分別與pCHF3 載體gfp基因前的35S 啟動(dòng)子置換，獲得植物表達(dá)載體pCHF P1和pCHF P5。
　　 2．植物表達(dá)載體以根癌土壤桿菌介導(dǎo)進(jìn)行瞬間表達(dá)
　　 將啟動(dòng)子系列表達(dá)載體pINT P1、pINT P

4、2、pINT P3、pINT P4、pINT P5和pINT121 電擊導(dǎo)入根癌土壤桿菌，菌液注射本氏煙莖部，組織化學(xué)染色進(jìn)行啟動(dòng)子活性的定性鑒定；同樣將表達(dá)載體pCHF P1、pCHF P5和pCHF3分別電擊導(dǎo)入根癌土壤桿菌，菌液注射本氏煙莖部，通過熒光顯微鏡觀察鑒定各啟動(dòng)子的活性。再用根癌土壤桿菌菌液浸潤(rùn)本氏煙葉片，利用gus 熒光光度測(cè)定法進(jìn)行啟動(dòng)子活性的定量分析，鑒定不同啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱。
　　 3．瞬間表達(dá)中g(shù)us 活

5、性的組織化學(xué)檢測(cè)和gfp 熒光活性觀察
　　 利用組織化學(xué)染色法鑒定啟動(dòng)子的活性，染色結(jié)果表明，在pINT P1、pINTP2、pINT P3、pINT P4、pINT P5和pINT121表達(dá)的植株莖部的維管組織和部分皮層細(xì)胞均能觀察到藍(lán)色位點(diǎn)，說明各啟動(dòng)子都能驅(qū)動(dòng)gus基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。從各切片的gus 染色強(qiáng)度上來看，pINT P1的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因的表達(dá)水平要高于陽(yáng)性對(duì)照pINT121的35S 啟動(dòng)子。
　

6、　 利用熒光顯微鏡觀察啟動(dòng)子的活性，熒光觀察表明，在pCHF P1和pCHF P5和pCHF3表達(dá)的植株維管組織均能觀察到綠色熒光，說明各啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)gfp基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。從各切片的gfp 熒光強(qiáng)度上來看，pCHF P1中g(shù)fp基因的表達(dá)水平要高于陽(yáng)性對(duì)照pCHF3。用根癌土壤桿菌菌液注射本氏煙的植株作為陰性對(duì)照，莖桿切片中幾乎觀察不到綠色熒光。
　　 4．瞬間表達(dá)中g(shù)us 熒光活性分析熒光光度法測(cè)定
　　 結(jié)

7、果表明，pINT P1的平均相對(duì)gus 活性最高，達(dá)pINT121的280％。pINT P2、pINT P3、pINT P4、pINT P5的gus 活性分別為pINT121的29％、87％、125％和162％，與pINT P1 差異顯著（P<0.05）。以根癌土壤桿菌菌液浸潤(rùn)本氏煙葉片作為空白對(duì)照，幾乎沒有g(shù)us表達(dá)活性。
　　 5．轉(zhuǎn)基因普通煙gus 活性的組織化學(xué)檢測(cè)
　　 轉(zhuǎn)基因普通煙幼苗的gus組織化學(xué)染色分析

8、表明，pINT P1、pINT P5和pINT121 轉(zhuǎn)基因植株的葉片藍(lán)色最深，而莖桿和根部藍(lán)色相對(duì)較淺，說明SVBV啟動(dòng)子和CaMV 35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因均在葉片組織中表達(dá)強(qiáng)度最高。莖橫切面組織化學(xué)染色表明，pINT P1 轉(zhuǎn)基因煙草的莖橫切面藍(lán)色比對(duì)照pINT121 深，說明中國(guó)SVBV 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因穩(wěn)定表達(dá)的活性高于CaMV 35S 啟動(dòng)子。另外，SVBV 啟動(dòng)子與CaMV 35S 啟動(dòng)子一樣，不僅能夠驅(qū)動(dòng)gus基

9、因在煙草的根、莖、葉各個(gè)部位表達(dá)，而且在莖桿的表皮細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、皮層細(xì)胞、維管和髓部細(xì)胞均能表達(dá)。因此，可將SVBV 啟動(dòng)子鑒定為一個(gè)組成型表達(dá)啟動(dòng)子。
　　 6．轉(zhuǎn)基因普通煙的gus 熒光活性分析及gus mRNA的半定量RT-PCR檢測(cè)熒光光度法測(cè)定
　　 結(jié)果表明，pINT P1 啟動(dòng)子的平均相對(duì)gus 活性最高，并且pINT P1和pINT P5的驅(qū)動(dòng)活性都高于pINT121。這從翻譯水平上，驗(yàn)證了SVBV啟動(dòng)

10、子驅(qū)動(dòng)gus基因的表達(dá)活性高于CaMV 35S 啟動(dòng)子。
　　 提取穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因普通煙總RNA，半定量RT-PCR分析表明，相同循環(huán)數(shù)下，pINT P1和pINT121 內(nèi)參β-actin基因條帶亮度基本相同，而pINT P1的gus基因條帶亮度明顯高于pINT121。這說明pINT P1 轉(zhuǎn)基因植物中g(shù)us基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 積累量顯著高于pINT121，也驗(yàn)證了中國(guó)SVBV 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CaMV