NADPH氧化酶4在心肌缺氧-復(fù)氧損傷中的作用及機(jī)制研究：線粒體NAD+-NADH-Sirt3信號(hào)機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的：
　　冠心病所致心肌缺血以及溶栓、支架植入等臨床治療所伴隨的再灌注損傷嚴(yán)重影響冠心病的預(yù)后。如何在有效恢復(fù)心肌血流灌注的同時(shí)降低心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)損傷,一直是有待突破的醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)?；钚匝醮?reactive oxygen species,ROS)及其介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和隨之造成的線粒體損傷是 MI/R損傷的重要機(jī)制之一。MI/R損傷中線粒體電子

2、傳遞鏈酶系和N AD PH氧化酶系(nadph oxidases,Noxs)是ROS的兩大主要供體,并且它們之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響。一些研究發(fā)現(xiàn)Nox2和Nox4能夠誘導(dǎo)ROS的大量生成,在多種心臟疾病模型中發(fā)揮了明顯的損傷作用。然而,最近相繼有研究顯示Nox4在心臟受到慢性應(yīng)激時(shí)扮演了重要的保護(hù)性角色。目前對(duì)Nox4的研究多集中在血管病理性損傷、心肌肥厚和心衰等,在MI/R損傷中的研究則少有報(bào)道。
　　因此,本研究以H9C2心肌

3、細(xì)胞系為研究對(duì)象,建立體外缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,采用RNAi方法下調(diào)Nox4的表達(dá),以明確內(nèi)源性Nox4在心肌細(xì)胞H/R損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制,為臨床防治MI/R損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的研究方向。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　實(shí)驗(yàn)一:建立H9C2心肌細(xì)胞H/R模型,探討內(nèi)源性Nox4在H/R損傷中的作用。
　　1.建立H/R模型,采用RNAi的方法下調(diào)Nox4的表達(dá),將H9C2心肌

4、細(xì)胞隨機(jī)分為 control組、NC-siRNA組、Nox4-siRNA組、H/R組、H/R+NC-siRNA組和H/R+Nox4-siRNA組。
　　2.分別采用Western blot法測(cè)定各組Nox4表達(dá)水平、四甲基偶氮唑藍(lán)法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)測(cè)定細(xì)胞生存率、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(erminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated

5、nick end labeling,TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、分光光度法檢測(cè)caspase-3活性、DCFH-DA熒光探針檢測(cè)胞漿內(nèi)ROS含量以及比色法測(cè)定丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)水平。
　　實(shí)驗(yàn)二:明確內(nèi)源性Nox4在H9C2心肌細(xì)胞H/R損傷中發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制。
　　1.建立H/R模型,采用RNAi的方法下調(diào)Nox4的表達(dá),將H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為 control組、NC-siRNA

6、組、Nox4-siRNA組、H/R組、H/R+NC-siRNA組和H/R+Nox4-siRNA組。
　　2.分別采用MitoSOX熒光探針檢測(cè)線粒體ROS、JC-1熒光探針?lè)治鼍€粒體膜電位水平、熒光素酶化學(xué)發(fā)光法測(cè)定ATP含量、比色法測(cè)定NAD+/NADH的比值、Western blot法測(cè)定Sirt3蛋白表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.與control組相比,H/R組H9C2心肌細(xì)胞的Nox4表達(dá)量明顯升高(P<

7、0.01),細(xì)胞生存率降低(P<0.01),細(xì)胞凋亡明顯增多(P<0.01),caspase-3活性顯著增高(P<0.01),同時(shí)伴隨著胞漿內(nèi)ROS生成增多和脂質(zhì)氧化水平增高(P<0.01)。與H/R組相比,H/R+Nox4-siRNA組Nox4蛋白水平顯著降低(P<0.01),細(xì)胞生存率進(jìn)一步降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡進(jìn)一步增多(P<0.01),caspase-3活性進(jìn)一步增高(P<0.01),同時(shí)伴隨著胞漿內(nèi)ROS生成和脂質(zhì)氧化

8、水平的進(jìn)一步增高。
　　2.與control組相比,H/R組H9C2心肌細(xì)胞線粒體ROS生成明顯增加(P<0.01),線粒體膜電位和ATP水平顯著降低(P<0.01),NAD+/NADH比值明顯增加(P<0.01),Sirt3表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。與H/R組相比,H/R+Nox4-siRNA組線粒體ROS生成進(jìn)一步增加(P<0.01),線粒體膜電位和ATP水平進(jìn)一步缺失(P<0.05),NAD+/NADH比值明顯降低(P

9、<0.01),而Sirt3蛋白水平進(jìn)一步降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　下調(diào)Nox4的表達(dá)顯著加重H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷、增加胞漿內(nèi)ROS的生成以及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),這些結(jié)果提示內(nèi)源性 Nox4在 H/R損傷中發(fā)揮著心肌細(xì)胞保護(hù)作用。內(nèi)源性Nox4發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)NAD+/NADH比值,增加Sirt3的表達(dá),減輕線粒體氧化損傷和能量合成障礙來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)Nox4的心臟保護(hù)效應(yīng)提供