EPO預(yù)處理在心肌缺氧復(fù)氧損傷中的保護(hù)作用及其NF-κB信號(hào)機(jī)制的研究.pdf

1、EPO是一種造血生長(zhǎng)因子，主要作用為促進(jìn)紅系祖細(xì)胞分裂、分化為成熟紅細(xì)胞，從而增加循環(huán)紅細(xì)胞數(shù)量，已廣泛用于治療腎衰、腫瘤化療、AIDS及手術(shù)等各種原因造成的貧血。近年的研究發(fā)現(xiàn)，EPO具有多種非造血生物作用，其中在多種組織多種損傷因素作用下的保護(hù)效已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)EPOR表達(dá)于心肌細(xì)胞，提示EPO可以直接作用于心肌細(xì)胞，然而目前有關(guān)EPO心肌保護(hù)作用的研究還很少。為此，本研究通過(guò)建立大鼠缺氧復(fù)氧心肌損傷模型及培養(yǎng)新生

2、大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，觀察EPO預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)NF-κB與心肌缺血預(yù)適應(yīng)及一些藥物預(yù)處理的保護(hù)作用有關(guān)，且EPO可以活化NF-κB，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可能參與EPO組織保護(hù)作用的信號(hào)分子，如PI3K/Akt，MAPKs及JAK2等均可活化NF-κB，因此，本課題進(jìn)一步研究了EPO預(yù)處理心肌保護(hù)作用的NF-κB信號(hào)機(jī)制。 研究方法： 本研究分為三部分： 在第一部分中，建立大鼠缺氧復(fù)氧心肌損傷模

3、型，觀察EPO預(yù)處理的心肌保護(hù)效應(yīng)，同時(shí)以Westernblot和免疫組化染色檢測(cè)成年大鼠心肌EPOR蛋白的表達(dá)及分布，以免疫組化染色觀察EPO預(yù)處理對(duì)缺氧復(fù)氧前后心肌凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax及炎癥基因TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響，以EMSA觀察對(duì)心肌NF-κB活性的影響。 在第二部分中，培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，建立培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型。觀察EPO預(yù)處理對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，同時(shí)觀察在EPO預(yù)處理過(guò)程中加

4、入NF-κB的阻斷劑PDTC對(duì)其心肌保護(hù)作用的影響。 在第三部分中，以EMSA觀察EPO預(yù)處理及預(yù)處理過(guò)程中同時(shí)加入PDTC對(duì)缺氧復(fù)氧前后心肌細(xì)胞NF-κB活性的影響，Westernblot觀察對(duì)I-κBα蛋白表達(dá)水平的影響，Westernblot、RT-PCR觀察對(duì)bcl-2及TNF-α表達(dá)的影響，探討bcl-2、TNF-α表達(dá)變化與NF-κB活性、I-κBα蛋白表達(dá)水平變化的關(guān)系，研究EPO預(yù)處理心肌保護(hù)作用的NF-κB信號(hào)

5、機(jī)制。 研究結(jié)果： 第一部分： 缺氧復(fù)氧對(duì)大鼠心肌造成明顯損傷，而EPO預(yù)處理在大鼠心肌缺氧復(fù)氧損傷中具有顯著的保護(hù)作用；免疫組化及Westernblot結(jié)果提示成年大鼠心肌能夠表達(dá)EPOR蛋白，主要分布于心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，EPO預(yù)處理及缺氧復(fù)氧對(duì)心肌EPOR蛋白表達(dá)水平及分布無(wú)顯著影響；EPO預(yù)處理使缺氧復(fù)氧損傷前大鼠心肌NF-κB活化，抑制損傷后NF-κB活性的升高，使損傷前后大鼠心肌bcl-2蛋白

6、表達(dá)及bcl-2/bax增加，抑制損傷后TNF-α蛋白表達(dá)上調(diào)。 第二部分： EPO預(yù)處理在培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中具有顯著的保護(hù)作用，表現(xiàn)為減少心肌細(xì)胞LDH漏出，抑制心肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)心肌細(xì)胞生存；在EPO預(yù)處理過(guò)程中同時(shí)加入PDTC，其心肌保護(hù)作用顯著減弱或消失。 第三部分： EPO預(yù)處理使缺氧復(fù)氧前心肌細(xì)胞NF-κB活化，且存在時(shí)間依賴性，抑制缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞NF-κB活性的升高，預(yù)處理過(guò)程中

7、加入PDTC這一作用消失；使缺氧復(fù)氧前I-κBα蛋白表達(dá)水平降低，存在時(shí)間依賴性，抑制缺氧復(fù)氧后I-κBα蛋白表達(dá)水平的下降，加入PDTC這一變化消失；使缺氧復(fù)氧前后bcl-2基因表達(dá)上調(diào)，加入PDTC抑制了這一作用；對(duì)缺氧復(fù)氧前TNF-α基因表達(dá)無(wú)顯著影響，抑制缺氧復(fù)氧后TNF-α基因表達(dá)上調(diào)，EPO預(yù)處理過(guò)程中加入PDTC，這一作用消失。 結(jié)論： 1.成年大鼠心肌能夠表達(dá)EPOR蛋白，呈弱陽(yáng)性，主要分布于心肌細(xì)胞的胞

8、漿，心肌間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿也有較微弱的表達(dá)，EPO預(yù)處理及缺氧復(fù)氧對(duì)其表達(dá)水平及分布無(wú)顯著影響。 2.EPO預(yù)處理對(duì)大鼠缺氧復(fù)氧心肌損傷具有保護(hù)作用，主要為減少心肌酶的漏出，抑制氧自由基產(chǎn)生，維持心肌超微結(jié)構(gòu)完整，抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)復(fù)氧心功能恢復(fù)等。 3.EPO預(yù)處理在培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中，促進(jìn)損傷后細(xì)胞生存，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌酶漏出，這一作用與EPO預(yù)處理過(guò)程中NF-κB的活化有關(guān)。 4.

9、EPO預(yù)處理使心肌細(xì)胞NF-κB活化，進(jìn)而可能通過(guò)上調(diào)I-κBα基因表達(dá)而抑制缺氧復(fù)氧后心肌I-κBα蛋白表達(dá)水平的降低，負(fù)反饋性的抑制缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞NF-κB活性的升高。 5.EPO預(yù)處理可能通過(guò)啟動(dòng)NF-κB活化的負(fù)反饋機(jī)制抑制缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞NF-κB活性的升高，進(jìn)而抑制缺氧復(fù)氧后心肌TNF-α基因表達(dá)上調(diào)。 6.EPO預(yù)處理過(guò)程中心肌細(xì)胞NF-κB活化，使缺氧復(fù)氧前后心肌細(xì)胞抗凋亡基因bcl-2表達(dá)上調(diào)，抑