糖皮質(zhì)激素通過快速非基因組機制抑制中性粒細胞性炎癥及提高急性應激耐受力.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體分子及其人工合成類似物，它對機體的發(fā)育、生長、代謝以及免疫功能等起著重要調(diào)節(jié)作用，是機體應激反應的樞紐，在應激反應和應激損傷中起關(guān)鍵性作用，也是臨床上使用廣泛而療效顯著的抗炎、抗過敏和免疫抑制劑。GCs除經(jīng)典的基因組機制外，還存在著非基因組作用機制。
　　 GCs非基因組機制常見于討論大劑量沖擊療法的作用機制。在GCs大劑量沖擊療法時，GCs劑量遠高

2、于飽和體內(nèi)所有GCs受體(glucocorticoidsreceptor，GCR)所需要的濃度，對此基因組機制是無法解釋的。但是GCs非基因組機制的分子作用靶點仍有待進一步實驗研究揭示。糖皮質(zhì)激素大劑量沖擊療法是急性肺損傷、急性脊髓損傷、COPD、急性活動期類風濕關(guān)節(jié)炎等眾多急重癥的特效治療方法。這些GCs大劑量沖擊療法的適應癥中多數(shù)病理表現(xiàn)為中性粒細胞(neutrophil，又稱多形核白細胞，polymorphonuclearleuk

3、ocyte，PMN)性炎癥損傷，顧名思義，其主要炎癥細胞為PMN。PMN是非常關(guān)鍵的固有免疫細胞，從其數(shù)量占人外周血白細胞總數(shù)的50～70％可見一斑。細菌、病毒、異物等多種刺激均可以活化PMN?；罨腜MN是一把雙刃劍，它通過吞噬、脫顆粒、呼吸爆發(fā)及分泌促炎細胞因子，既參與機體防御功能和免疫反應，同時又可帶來組織的繼發(fā)性損傷，是多種疾病的主要炎癥細胞。因而，GCs對PMN作用的研究一直受到廣泛的重視。我們課題組前期研究表明大劑量GCs具

4、有快速抑制PMN脫顆粒的效應，而抑制磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase4，PDE4)可能是其作用機制之一。本課題研究第一部分在此基礎(chǔ)上，以中性粒細胞(neutrophils，PMN)為研究對象，建立了在體和離體炎癥模型，以求在整體動物炎癥模型證明GCs大劑量沖擊療法中存在非基因組作用；以偶聯(lián)氨基酸新型GCs進一步驗證GCs快速抑制PMN脫顆粒為非基因組效應；并通過研究胞內(nèi)游離鈣離子([Ca2+]i)、胞膜流動性、胞膜脂筏等

5、關(guān)鍵靶點，以其進一步闡明GCs抑制中性粒細胞性炎癥的非基因組分子機制。
　　 GCs非基因組機制的臨床意義日趨明朗并逐漸被接受，但機體這一與生俱來的重要的調(diào)節(jié)機制不可能僅為臨床用藥準備著，必然有其重要的生理調(diào)節(jié)意義。目前，學術(shù)界公認GCs通過基因組機制發(fā)揮作用的時間一般至少需要30分鐘。故認為在急性應激起始階段交感-腎上腺髓質(zhì)軸發(fā)揮著重要作用，交感-腎上腺髓質(zhì)在應激時快速分泌兒茶酚胺，具有興奮心血管、呼吸系統(tǒng)、升高血糖等防御代償

6、意義。而許多急性應激反應的初始階段即有大量糖皮質(zhì)激素分泌，并有多種生理生化指標產(chǎn)生快速改變。GCs分泌增多是應激反應中最重要的環(huán)節(jié)。動物實驗表明，摘除雙側(cè)腎上腺的動物只能在沒有應激的狀態(tài)下生存，輕微的有害刺激即可導致其死亡。但如僅去除腎上腺髓質(zhì)而保留腎上腺皮質(zhì)，則動物的生存能力增強。給摘除腎上腺的動物注射GCs，可使動物恢復抗損傷的能力。可見，機體調(diào)節(jié)應激反應離不開GCs，故我們推測急性應激早期即有GCs非基因組機制參與調(diào)節(jié)，但是目前還

7、缺乏有力實驗依據(jù)。因此，在本課題的第一部分，我們以去腎上腺小鼠急性負荷強迫游泳(AcuteWeight-LoadedForcedSwimming，AWLFS)力竭應激模型，觀察應激劑量GCs對小鼠游泳力竭時間的快速調(diào)節(jié)作用，并應用GCs核受體拮抗劑RU486排除經(jīng)典基因組機制調(diào)節(jié)作用。在組織器官水平，應用病理切片HE染色和電鏡檢測了GCs對主要靶器官骨骼肌力竭損傷的快速保護作用。檢測血糖、血乳酸、NO、骨骼肌ATP等重要生理和生化指標。

8、在細胞水平，利用小鼠骨骼肌C2C12細胞株分化成肌管細胞，以ACh刺激肌管細胞強直收縮模擬力竭運動，檢測GCs對肌管細胞葡萄糖攝取、NO合成釋放的影響。探索GCs在調(diào)節(jié)急性應激反應中的非基因組作用及其初步分子機制。
　　 主要實驗結(jié)果如下：
　　 一、糖皮質(zhì)激素通過快速非基因組機制抑制中性粒細胞性炎癥：
　　 1.大劑量甲強龍(0.04mg/gbodywti.v.)抑制了甲酰三肽(N-formyl-methion

9、yl-leucyl-phenylalanine，fMLP)引發(fā)的小鼠急性全身性炎癥反應血漿MPO、乳鐵蛋白等中性粒細胞脫顆粒源性炎性介質(zhì)釋放。
　　 2.偶聯(lián)氨基酸新型GCs可在其作用10分鐘內(nèi)抑制PMN脫顆粒。
　　 3.大劑量GCs在15分鐘內(nèi)對PMN無細胞毒性作用，反而具有保護作用。
　　 4.GCs加快fMLP激發(fā)的PMN[Ca2+]i升高快速恢復正常，并且不能被RU486、CHX阻斷。
　　 5

10、.甲強龍(104-4～10-5M)，fMLP自身均具有快速升高PMN胞膜熒光偏振度，降低PMN胞膜流動性的作用。MP與fMLP同時作用下，PMN微黏度較兩者中任何一個單獨作用都顯著降低。
　　 6.甲強龍及偶聯(lián)BSA的皮質(zhì)酮預處理可抑制fMLP引發(fā)的PMN胞膜脂筏呈多點聚集現(xiàn)象，RU486、CHX均不能阻斷這一效應，但是以MβCD破壞胞膜脂筏，對甲強龍抑制PMN脫顆粒效應無影響。
　　 二、糖皮質(zhì)激素通過快速非基因組機制

11、提高急性負荷強迫游泳力竭應激耐受力：
　　 1.利用去腎上腺小鼠急性負荷游泳力竭應激模型，發(fā)現(xiàn)GCs在早期(20分鐘內(nèi))即可以顯著延長小鼠的游泳力竭時間，而GCs受體拮抗劑RU486不能阻斷GCs的這一早期效應。
　　 2.在組織器官水平，組織病理觀察：HE染色結(jié)果顯示負荷游泳力竭小鼠骨骼肌部分肌纖維斷裂、溶解，GCs能夠在作用20分鐘內(nèi)減輕充血和肌纖維的損傷。電鏡觀察到負荷游泳力竭小鼠腓腸肌肌原纖維部分溶解、肌漿網(wǎng)空泡

12、化，部分M線及Z線模糊消失、線粒體固縮、密度增高，而GCs預處理組損傷不明顯。
　　 3.在整體動物水平，GCs快速降低游泳力竭小鼠血漿NO水平，NOS抑制劑L-NAME單獨或聯(lián)用GCs均可延長小鼠力竭時間。GCs可快速抑制ACh引起的肌管細胞NO釋放，RU486不能阻斷。GCs可快速升高力竭游泳小鼠血糖和骨骼肌組織ATP，并不能被RU486阻斷，但在細胞水平抑制骨骼肌細胞葡萄糖攝取。
　　 結(jié)論：
　　 以上結(jié)

13、果表明：
　　 1.大劑量GCs具有體內(nèi)外快速抑制PMN脫顆粒的非基因組效應，可能是GCs治療急性肺損傷、急性脊髓損傷、COPD、RA等許多中性粒細胞性炎癥性疾病的重要機制之一；GCs促進fMLP激發(fā)的PMN升高快速恢復，可能是GCs快速抑制PMN脫顆粒的非基因組作用靶點之一；GCs對PMN胞膜脂筏、膜流動性的快速作用并非GCs快速抑制PMN脫顆粒的作用靶點。
　　 2.GCs非基因組機制存在于急性應激反應這一生理進程中

14、，應激時GCs大量快速分泌具有其非基因組機制的生理意義；GCs一方面通過快速抑制NO系統(tǒng)過度活化升高骨骼肌組織ATP并解除NO對肌力的直接或間接抑制，另一方面通過抑制骨骼肌等細胞攝取葡萄糖快速升高力竭游泳小鼠血糖途徑提高機體對急性力竭應激反應的耐受力。
　　 本研究表明，藥理劑量GCs具有非基因組抗炎效應，GCs對[Ca2+]i外流的調(diào)節(jié)是其可能作用靶點；GCs的生理效應中存在防護應激損傷的非基因組調(diào)節(jié)機制，NO-NOS系統(tǒng)可能