抗菌肽PR39靶向巨噬細胞表達抗胞內菌感染研究.pdf

1、感染性疾病，尤其是慢性持續(xù)性感染疾病，是危害動物和人類健康與生命的全球性頑疾之一。其中許多難治且危害嚴重的感染（如結核、病毒性肝炎等）均與細胞內微生物感染有關。常見的胞內感染細菌主要有：結核桿菌、傷寒沙門氏菌、嗜肺軍團菌、麻風桿菌等。這些胞內感染菌進入人體后，能以不同方式逃避巨噬細胞的殺滅并在細胞內生存、繁殖，還能夠逃避體液免疫和抗生素的殺滅作用，使巨噬細胞反而成為庇護所，導致臨床治療困難。 抗菌肽（antimicrobial

2、peptides，AMP）是一類具有抗菌活性的多肽，是動物和植物免疫防御系統(tǒng)產生的對抗病原體致病作用的防御性肽類活性物質，在生物體的天然免疫中起著重要的作用。抗菌肽具有廣譜、高效的抗菌活性，與其他抗菌藥物不易產生交叉耐藥性，而且不易誘導耐藥菌株的產生?？咕腜R39是最初從豬小腸中分離純化出的一種富含脯氨酸的抗菌肽，是抗菌肽cathelicidin家族中的一員?？咕腜R39對細菌（如結核分支桿菌、傷寒沙門氏菌等）具有廣譜、高效的抗菌作

3、用。除了抗菌作用以外，PR39還具有中和內毒素、抗炎、免疫誘導、組織修復、抑制凋亡等功能。所以與傳統(tǒng)抗生素相比，PR39在細菌感染的治療中，具有多方面優(yōu)勢，有望成為治療胞內細菌感染的新一代抗菌藥。 然而，抗菌肽在臨床實際應用中仍面臨著很多問題：①天然抗菌肽分離純化困難，成本較高，患者不易承受。②作為多肽，口服易被消化破壞，只能靜脈或肌注給藥，應用不便，并可能引起過敏反應。③容易降解，需要持續(xù)給藥。④同其他普通抗生素一樣，抗菌肽不

4、易在細胞內富集，從而難以發(fā)揮其對胞內菌的抗菌作用。因此PR39和其他抗菌肽的臨床應用，特別是在胞內菌感染治療中受到了較大限制。而尋找合理、有效、方便而且經濟的治療方式，成為PR39等新型高效抗菌肽應用于胞內菌感染治療的關鍵問題。 研究目的： 構建攜帶巨噬細胞特異性啟動子及抗菌肽PR39基因的重組腺病毒（Ad-SP-PR39），靶向巨噬細胞高效表達抗菌肽PR39基因。從體外細胞水平和體內活體水平檢測目的基因在mRNA水平和

5、蛋白水平的表達及基因表達的靶向性，并進一步研究該重組腺病毒在體內外抗胞內菌感染的作用。為抗菌肽PR39在胞內微生物感染基因治療中的合理安全應用提供理論和實驗基礎。 研究方法： 1.采用拼接PCR方法合成抗菌肽PR39基因，經NheⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆入pIRES2-GFP載體，導入小鼠巨噬細胞株RAW264.7，篩選出穩(wěn)定表達株。通過熒光顯微鏡、RT-PCR、免疫細胞化學等方法檢測抗菌肽PR39基因在小鼠巨噬細胞中的

6、表達情況。采用平板活菌技術方法，檢測攜抗菌肽PR39基因的小鼠巨噬細胞RAW264.7在體外殺滅胞內菌、抵抗胞內菌感染的能力。 2.抗菌肽PR39多克隆抗體的制備：利用蛋白抗原決定簇預測軟件DNASTAR，預測抗菌肽PR39的抗原決定簇序列，用化學合成法合成其抗原決定簇序列。合成的多肽與KLH偶聯(lián)、純化后免疫家兔。制備的抗血清經鹽析純化后用SDS-PAGE和ELISA方法進行抗體的純度和滴度測定。 3.抗菌肽PR39原核

7、表達載體的構建及誘導表達：根據(jù)Genbank中抗菌肽PR39序列和大腸桿菌對密碼子的偏愛性，設計并合成PR39序列的拼接PCR引物，通過拼接PCR擴增合成PR39 DNA序列?？寺〉絧ET-32a（+）、pET28a、pQE30、pET31b等原核表達載體。在以上載體的基礎上，進一步構建了一系列PR39基因的串聯(lián)表達載體。并對構建的載體進行原核誘導表達。 4.根據(jù)GenBank中巨噬細胞特異性啟動子序列，設計并合成其拼接引物，通

8、過PCR方法拼接合成巨噬細胞特異性啟動子序列。克隆到真核表達載體pEGFP-N1中，替換其中的CMV啟動子，得到重組質粒pSP-GFP。將質粒pSP-GFP和pERFP-N1等摩爾濃度混合，用Lipofectamine2000轉染小鼠巨噬細胞株RAW264.7、人結腸癌細胞株Lovo、人肝癌細胞株HepG2、人乳腺癌細胞株ZR-75-30和非洲綠猴腎細胞株COS-7。轉染48h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達并計數(shù)。

9、 5.構建由巨噬細胞特異性啟動子調控的PR39基因穿梭質粒；將腺病毒骨架質粒pAdEasy-1轉入大腸桿菌BJ5183，制備AdEasier Cell并鑒定。將穿梭質粒轉化感受態(tài)AdEasier Cell，通過細菌內同源重組構建重組腺病毒質粒，進行酶切鑒定。將腺病毒質粒轉染293細胞，包裝出重組腺病毒Ad-SP-PR39，并擴增和純化。用重組腺病毒感染小鼠巨噬細胞RAW264.7，在轉錄水平和蛋白水平檢測目的基因的表達。并檢測Ad

10、-SP-PR39在各種細胞中表達目的基因的靶向性。 6.用重組腺病毒Ad-SP-PR39體外感染小鼠巨噬細胞RAW264.7，用平板活菌計數(shù)方法檢測巨噬細胞表達產物對傷寒桿菌和減毒牛型結核分支桿菌（BCG）的殺菌作用。將重組腺病毒經氣管感染C57BL/6小鼠肺部，肺組織冰凍切片，熒光顯微鏡觀察腺病毒在肺部的定位及存活情況；采用RT-PCR和免疫熒光技術檢測目的基因的表達及定位情況。C57BL/6小鼠經氣管感染BCG，感染細菌后再

11、經氣管感染重組腺病毒Ad-SP-PR39，并檢測腺病毒的表達產物PR39體內對減毒牛型結核分枝桿菌BCG的殺滅效果。 研究結果： 1.用拼接PCR成功擴增出抗菌肽PR39基因，并構建了其真核表達載體pIRES2-PR39，體外轉染小鼠巨噬細胞RAW264.7后，篩選出了目的基因的穩(wěn)定表達株。在細胞中檢測到目的基因轉錄水平和蛋白水平的表達。表達抗菌肽PR39的小鼠巨噬細胞RAW264.7的裂解產物具有較強抗菌作用；攜抗菌肽

12、PR39的巨噬細胞體外殺滅胞內傷寒桿菌的能力增強。 2.成功制備了家兔抗PR39多克隆抗體，抗體經鹽析純化后進行SDS-PAGE，電泳結果顯示制備的抗體純度較高。進一步用ELISA方法測定抗體效價，效價達1：10000。 3.成功構建了抗菌肽PR39基因的多種原核表達載體，反復嘗試了目的基因的單獨表達、串連表達、與Trx或KSI融合表達、融合后串連表達等多種表達模式，并對誘導表達條件進行多方面優(yōu)化。但是，由于抗菌肽PR3

13、9特殊的抗菌機制和強烈的抗菌活性，導致蛋白產量極低甚至幾乎不表達，最終無法得到大量的目的蛋白。 4.采用拼接PCR方法成功合成了巨噬細胞特異性的啟動子序列，構建了由巨噬細胞特異性啟動子調控的綠色熒光蛋白（GFP）真核表達載體pSP-GFP。質粒pSP-GFP和紅色熒光蛋白（RFP）真核表達載體pERFP-N1按1：1混合后，轉染巨噬細胞和多種非巨噬細胞。GFP和RFP在不同細胞中的表達具有差異，由巨噬細胞特異性啟動子調控的GFP

14、基因僅在巨噬細胞中高效表達，而在非巨噬細胞中則幾乎沒有表達。而以CMV啟動子啟動的RFP基因則在巨噬細胞和非巨噬細胞中均有相近的高表達。 5.構建了攜巨噬細胞啟動子及PR39基因的穿梭質粒和AdEasier Cell。利用細菌內同源重組原理，成功構建成由巨噬細胞特異性啟動子調控的PR39腺病毒表達載體（Ad-SP-PR39）。重組腺病毒經擴增純化后感染小鼠巨噬細胞，能夠有效表達目的基因。Ad-SP-PR39能夠靶向巨噬細胞有效表

15、達目的基因。 6.重組腺病毒Ad-SP-PR39體外感染小鼠巨噬細胞RAW264.7后，其表達的抗菌肽PR39能增強巨噬細胞對傷寒桿菌和減毒牛型結核分支桿菌（BCG）的殺菌作用。重組腺病毒經氣管感染C57BL/6小鼠肺部后，能夠有效定位到肺部，并能表達目的基因；采用RT-PCR和免疫熒光技術可以檢測目的基因的表達。C57BL/6小鼠經氣管感染重組腺病毒Ad-SP-PR39后，PR39基因表達產物能夠有效殺滅小鼠肺部的減毒牛型結核

16、分支桿菌BCG。 研究結論： 1.攜抗菌肽PR39基因的小鼠巨噬細胞RAW264.7能有效表達抗菌肽PR39，表達產物能增強巨噬細胞體外殺滅胞內傷寒桿菌的能力。 2.成功制備了抗菌肽PR39多克隆抗體。 3.由于抗菌肽PR39特殊的抗菌機制和強烈的抗菌活性，目前尚無法通過原核表達的方式得到大量的目的蛋白。 4.由巨噬細胞特異性啟動子調控的GFP基因能夠靶向巨噬細胞高效表達。為抗菌肽PR39基因的靶