豬抗菌肽PR39抗細菌感染和保護腸道屏障功能的作用及其機制研究.pdf

1、本研究從抗菌肽PR39調(diào)節(jié)動物腸道黏膜上皮屏障功能的角度出發(fā)，開展了三個試驗。
　　試驗一 抗首肽PR39在體內(nèi)的抗菌活性、穩(wěn)定性及分布研究
　　為了探明抗菌肽PR39在體內(nèi)是否具有抗菌活性，首先利用人工胃液、小腸液和血清模擬體內(nèi)環(huán)境，研究了其在體內(nèi)的抗菌活性和穩(wěn)定性。抗菌活性結果表明，在MH肉湯培養(yǎng)基中抗菌活性較強的PR39，在人工胃液和小腸液環(huán)境下其抗菌活性完全喪失，而在血清中保留了一部分抗菌活性。穩(wěn)定性試驗結果表明，P

2、R39與人工小腸液共同孵育5min即被快速降解為小肽，與人工胃液共同孵育1h內(nèi)也逐漸被降解完全，提示PR39在胃腸道環(huán)境下穩(wěn)定性極差，不宜直接口服。而PR39與血清共同孵育1h后，依然可檢測到約70％完整的PR39，其半衰期約為2h，提示PR39在血清里具有較好的穩(wěn)定性，宜通過注射給藥。進一步通過小鼠活體成像技術，觀察抗菌肽PR39經(jīng)腹腔注射后在體內(nèi)的分布代謝情況，結果表明，PR39經(jīng)腹腔注射后可迅速被腹膜吸收而進入機體循環(huán)系統(tǒng)，30

3、min內(nèi)遍布全身，并在24h內(nèi)完全代謝出體外，提示抗菌肽PR39經(jīng)腹腔注射途徑可以進入機體循環(huán)系統(tǒng)而發(fā)揮作用。
　　試驗二 抗菌肽PR39對小鼠抗細菌感染的作用研究
　　(1)抗首肽PR39對小鼠抗鼠傷寒沙門氏菌感染的作用研究
　　通過建立鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠模型，從表觀癥狀、炎癥反應及腸道黏膜上皮屏障功能三個方面研究了PR39對小鼠抗沙門氏菌感染的作用:抗菌肽PR39對沙門氏首感染小鼠表觀癥狀影響的結果表明，小鼠在

4、感染鼠傷寒沙門氏菌后，出現(xiàn)食欲下降、體重下降及軟便等癥狀，而腹腔注射PR39可以明顯緩解上述癥狀，且小鼠腎臟和肝臟中細菌移位數(shù)量也顯著降低，說明腹腔注射PR39顯著緩解了小鼠的沙門氏菌感染癥狀;抗菌肽PR39對沙門氏菌感染小鼠炎癥反應影響的結果表明，腹腔注射PR39的沙門氏菌感染小鼠其結腸組織的MPO濃度顯著低于沙門氏菌組(P＜0.05)，但仍高于正常對照組（P＜0.05），表明PR39在一定程度上減少了沙門氏菌感染引起的小鼠結腸嗜中性

5、粒細胞浸潤。但血清里炎性細胞因子含量及結腸中炎性細胞因子基因表達水平結果顯示，沙門氏菌組小鼠和腹腔注射PR39的沙門氏菌感染小鼠的促炎因子TNF-α、IL-8和抑炎因子IL-10的表達水平并無顯著差異，均顯著高于正常對照組（P＜0.05），提示PR39對炎性細胞因子的表達與分泌并無顯著影響;抗酋肽PR39對沙門氏菌感染小鼠腸道黏膜上皮屏障功能影響的結果表明，PR39顯著緩解了沙門氏菌感染造成的小鼠回腸絨毛高度變短、隱窩加深及絨毛/隱窩比

6、下降，同時也顯著改善了結腸形態(tài)。利用尤斯灌流室測定結腸跨上皮電阻值(TER)和測定灌胃后血清中FITC-dextran含量兩種方法來評價各組小鼠的腸道通透性，結果表明，腹腔注射PR39可以顯著緩解沙門氏菌引起的小鼠腸道通透性升高，且單獨添加PR39可能增強了小鼠的腸道屏障功能。
　　(2)抗苗肽PR39對小鼠抗腸出血性大腸桿菌感染的作用研究
　　本試驗進一步通過建立與鼠傷寒沙門氏菌作用機制完全不同的腸出血性大腸桿菌感染的小鼠

7、模型，從表觀癥狀、腎臟及腸道組織形態(tài)和腸道黏膜上皮屏障功能三個方面研究了抗菌肽PR39對小鼠抗大腸桿菌感染的作用:抗曹肽PR39對大腸桿菌感染小鼠表觀癥狀影響的結果表明，小鼠在感染腸出血性大腸桿菌后，體重顯著下降，結腸組織MPO含量急劇升高，而腹腔注射PR39顯著緩解了上述癥狀，腎臟和肝臟中移位的細菌數(shù)量及概率也明顯降低;抗菌肽PR39對大腸桿菌感染小鼠腎臟及腸道組織形態(tài)影響的結果表明，PR39顯著緩解了腸出血性大腸桿菌感染導致的小鼠腎

8、臟腎間質(zhì)血管和腎小球毛細血管充血、擴張等腎臟損傷，并且對小鼠回腸絨毛受損、黏膜下層充血，及結腸固有層水腫等形態(tài)破壞具有一定的改善作用。透射電鏡結果顯示，大腸桿菌感染后小鼠結腸上皮細胞遭到大腸桿菌的粘附與破壞，其微絨毛明顯扭曲、變短和斷裂，上皮細胞間緊密連接打開，而腹腔注射PR39的大腸桿菌感染小鼠結腸上皮細胞微絨毛排列整齊，形態(tài)正常，上皮細胞間緊密連接清晰。上述結果顯示PR39對大腸桿菌感染導致的腎臟及腸道組織形態(tài)受損具有一定的保護作用

9、;抗菌肽PR39對大腸桿菌感染小鼠腸道黏膜上皮屏障功能影響的結果表明，相比于大腸桿菌組，腹腔注射PR39后小鼠結腸TER值顯著升高(P＜0.05)，血清中FITC-dextran含量顯著降低(P＜0.05)，表明腹腔注射PR39可以顯著緩解腸出血性大腸桿菌引起的腸道通透性升高。此外，PR39顯著緩解了大腸桿菌感染引起的小鼠結腸ZO-1和Occludin的基因表達水平下降，且PR39單獨處理組小鼠結腸Occludin的基因表達水平顯著高于

10、正常對照組(P＜0.05)。各處理組之間ZO-2和Claudin-1的基因表達水平差異不明顯。
　　試驗三 抗菌肽PR39調(diào)控腸道屏障功能的作用機制研究
　　(1)抗首肽PR39對細菌感染豬腸道上皮細胞屏障功能的影響
　　在上述結果的基礎上，進一步利用體外豬腸道上皮細胞(IPEC-1)細菌感染模型研究PR39對細菌感染后上皮細胞的緊密連接蛋白Occludin和細胞骨架蛋白F-actin的表達與分布、粘附與入侵細胞的細菌

11、數(shù)量及上皮細胞通透性的影響。首先，不同濃度PR39作用于IPEC-1細胞后細胞的增值率和LDH釋放率的結果表明，PR39對IPEC-1細胞的毒性較小。免疫熒光試驗觀察各組上皮細胞的Occludin和F-actin的表達與分布結果表明，沙門氏菌或大腸桿菌分別刺激IPEC-1細胞4h后，細胞Occludin熒光值減弱并從細胞膜往細胞質(zhì)分布，F(xiàn)-actin排列紊亂，出現(xiàn)應力纖維，而2μg/mL PR39預處理明顯改善了沙門氏菌和大腸桿菌感染引

12、起的豬腸道上皮細胞緊密連接蛋白Occludin的表達下降和分布異常以及細胞骨架的重排。利用Transwell培養(yǎng)IPEC-1細胞細菌感染模型研究PR39對細菌粘附與入侵，以及細胞通透性的影響發(fā)現(xiàn)，兩種試驗設計（2μg/mL PR39預處理IPEC-1細胞后不洗去直接進行細菌感染，或洗去后再進行細菌感染）均能顯著減少沙門氏菌的入侵數(shù)和大腸桿菌的粘附數(shù)(P＜0.05)，且體外抑菌試驗結果顯示PR39濃度為2μg/mL時對沙門氏菌和大腸桿菌都

13、沒有抗菌活性。測定各組細胞TER值發(fā)現(xiàn)，PR39能顯著緩解細菌感染導致的IPEC-1細胞通透性升高(P＜0.05)。以上結果提示抗菌肽PR39可能通過增強腸道上皮細胞屏障功能發(fā)揮了抗細菌粘附與入侵的作用，而不是通過其抗菌作用實現(xiàn)的。
　　(2)單獨添加抗菌肽PR39對豬腸道上皮細胞屏障功能的影響
　　利用研究緊密連接蛋白組裝的經(jīng)典方法Calcium Switch，進一步研究單獨添加PR39對上皮細胞通透性及緊密連接蛋白Occ

14、ludin表達的影響。結果表明，在細胞培養(yǎng)基中缺鈣再恢復鈣離子后，2μg/mL及以上濃度PR39處理組的TER值恢復速度顯著快于對照組，而且0.5μg/mL以上濃度處理組均能提高IPEC-1細胞Occludin蛋白的表達。上述結果表明抗菌肽PR39可促進緊密連接蛋白Occludin的表達，調(diào)節(jié)腸道上皮細胞的通透性。
　　(3)基因芯片分析抗菌肽PR39對豬腸道上皮細胞基因表達的影響
　　利用基因芯片技術篩選PR39處理后豬腸

15、道上皮細胞IPCE-1的差異表達基因，結果表明，基因表達差異達2倍以上的基因共有138個，其中表達上調(diào)的基因有134個，下調(diào)的基因為3個。通過MAS3.0分析得出這些差異表達基因涉及的通路包括Tight junction、Regulation of actin cytoskeleton和Pathogenic Escherichia coli infection-EHEC等與本研究密切相關的信號通路，這些通路多涉及Rho小G蛋白家族(Rh

16、o GTPase)、WASL、PRKAA1及MAP3K5等基因，其中與Rho GTPase家族成員相關的通路最多。
　　(4)抗菌肽PR39調(diào)控豬腸道上皮細胞緊密連接蛋白的分子機制研究
　　由于基因芯片結果的啟發(fā)，從Rho GTPase家族入手，進一步研究PR39調(diào)節(jié)腸道上皮細胞屏障功能的分子機制。G-LISA法測定細胞中RhoA，Rac1和Cdc42的活化水平試驗結果表明，抗菌肽PR39處理細胞5 min和24 h后，IP

17、EC-1細胞Rac1的活化量較正常對照組顯著升高(P＜0.05)，而RhoA與Cdc42均無顯著變化。利用Rac1的專一抑制劑NSC23766研究抑制Rac1的活化后對PR39作用的影響，結果表明，抑制Rac1的活化后，PR39對豬腸道上皮細胞通透性的改善作用及對Occludin表達量的提升作用均受到抑制。而且，PR39對沙門氏菌入侵和大腸桿菌粘附的減少作用也被部分抑制。上述結果表明抗菌肽PR39通過促進Rho GTPase家族成員Ra