三種抗菌肽的異源表達(dá)、純化和抑菌活性研究.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptides)是機(jī)體產(chǎn)生的一類能夠抑制微生物甚至癌細(xì)胞，并且對(duì)自身起到保護(hù)防御的小分子陽離子多肽?？咕膶?duì)污染食品的G+和G-有較強(qiáng)的抑制作用，溶解性和穩(wěn)定性好，抗菌譜廣，極有潛力發(fā)展成為一種新型的天然食品防腐劑。本論文采用基因工程法表達(dá)三種抗菌肽，旨在為生產(chǎn)高活性、高產(chǎn)量的抗菌肽提供一種途徑。CFBD-1、UyCT5和Hispidalin分別來源于蠑螈皮膚分泌物、蝎子和冬瓜種子中，分子量分別為4

2、.5 KDa、1.4 KDa和5.7 KDa。
　　人工合成抗菌肽CFBD-1和UyCT5基因，將其分別克隆到大腸桿菌載體pMAL-c2X和pGEX-2T中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，在IPTG濃度為0.2 mmol/L，溫度為28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為6h條件下，融合蛋白MBP-CFBD-1不完全表達(dá)，GST-UyCT5成功表達(dá)。體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GST-Uy

3、CT5對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌151-1、單增李斯特菌和沙門氏菌均無抑菌活性。隨后將抗菌肽基因Hispidalin和CFBD-1克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒SacⅠ酶線性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，甲醇誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，在甲醇濃度為1％，250 mL搖瓶裝液量為25 mL，溫度為28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為144h條件下，His-Hispidalin融合蛋白表達(dá)量為120.2

4、1μg/mL。His-CFBD-1未表達(dá)。體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，His-Hispidalin融合蛋白對(duì)枯草芽孢桿菌151-1，L300-1，LZZ-133和單增李斯特菌有明顯的抑制作用。最小抑制濃度分別為75，67，83，75μg/mL。
　　最后，對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，在甲醇濃度為0.5％，250 mL搖瓶裝液量為50 mL，溫度為28℃，誘導(dǎo)時(shí)間為120 h條件下，His-Hispidalin融合蛋白最高表達(dá)量為133.87μg