竹葉天然抗菌肽的分離純化、抑菌活性與抑菌機(jī)理研究.pdf

1、竹葉的醫(yī)療保健作用早已為中國(guó)人所認(rèn)識(shí)，對(duì)其含有的生物活性成分的研究與開(kāi)發(fā)，具有十分重要的意義和價(jià)值。本論文為了研究開(kāi)發(fā)竹葉中新型天然抗菌肽，對(duì)竹葉中的活性多肽、蛋白，利用溶劑浸提、梯度鹽析沉降、透析除鹽后得到竹葉多肽蛋白粗提物，再經(jīng)過(guò)分子篩、弱陰離子交換柱層析等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，以獲得完全純化的竹葉抗菌肽。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析鑒定所得活性多肽的分子量和純度，以抑菌效果（抑菌圈直徑）來(lái)分析該竹葉天然抗菌肽的抑菌、防腐作

2、用以及其穩(wěn)定性等生理活性和功能，抑菌機(jī)理也得到初步研究。在本研究中，我們分離純化得到了一種新型的竹葉抗菌肽，該竹葉抗菌肽對(duì)細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及蠟狀芽孢桿菌）具有很好的抑制作用，并具有良好的應(yīng)用性能和穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)抗菌肽抑菌機(jī)理的研究，初步認(rèn)定竹葉抗菌肽是一種胰蛋白酶抑制劑。以上研究，為竹葉中新型、天然安全的抗菌肽的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和深入探索，提供了理論和實(shí)際基礎(chǔ)與技術(shù)支持。
　　 在本論文的研究中，首先，用P

3、BS緩沖液對(duì)竹葉粉進(jìn)行浸提，再分別進(jìn)行30％、60％、80％三級(jí)飽和硫酸銨鹽析梯度沉降，沉淀物經(jīng)截留分子量3000Da的透析袋透析后濃縮得到竹葉蛋白多肽粗提物。利用紙片法對(duì)粗提物進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，并用SDS-PAGE電泳法確定其分子量范圍。結(jié)果表明：竹葉多肽具有很強(qiáng)的抑菌活性，尤其對(duì)細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)，并且60％和80％飽和度硫酸銨鹽析下得出的提取物抑菌活性明顯強(qiáng)于30％飽和度。
　　 其次，分別采用凝膠層析法和離子交換色譜層析

4、法對(duì)竹葉蛋白肽粗提物進(jìn)行分離純化，最終分離得到純化的竹葉抗菌肽產(chǎn)物，SDS-PAGE凝膠電泳顯示純化物為兩個(gè)條帶，測(cè)得其相對(duì)分子量分別為99776Da和45604Da。根據(jù)以上結(jié)果分析，竹葉中的天然抗菌肽可能是兩種不同分子量的多肽混合物，也可能是同種蛋白肽的二聚體形式，具體分子結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步探索研究。
　　 再次，對(duì)純化的竹葉天然蛋白肽進(jìn)行抑菌譜、最低抑菌濃度、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性和酶穩(wěn)定性等性能研究，最終得出從

5、竹葉中提取出的天然抗菌肽具有廣譜的抗菌特性，尤其對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，并且在較低的濃度下就能對(duì)細(xì)菌表現(xiàn)出良好的抑制作用。對(duì)酵母菌也有一定的抑制作用，而對(duì)霉菌的抑制作用不明顯。該抗菌肽在pH3.0-11.0之間都很穩(wěn)定；在120℃加熱10min仍然穩(wěn)定存在：對(duì)不同的酶和有機(jī)溶劑也表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。
　　 最后，采用BAPNA法，初步探索了該竹葉天然抗菌肽的抑菌機(jī)理，該竹葉天然抗菌肽被證實(shí)具有抗胰蛋白酶活性，是一種胰蛋白酶抑