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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建攜帶色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)基因的重組腺病毒,為進一步基因治療脈絡膜新生血管(choroidalneovasculrization,CNV)奠定基礎。 方法:(1)從BN大鼠視網(wǎng)膜組織中提取總RNA。巢式RT-PCR擴增PEDF基因cDNA,將PEDF克隆入T載體,行DNA序列分析。提取PEDF質(zhì)粒和腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316,以EcoR Ⅰ和Hi
2、nd Ⅲ進行雙酶切,構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體pDC316/PEDF,提取重組質(zhì)粒后以SacⅠ酶進行酶切鑒定并進行DNA序列分析。脂質(zhì)體法將pDC3 16/PEDF質(zhì)粒與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞,利用Cre/loxp位點同源重組方法構(gòu)建重組腺病毒AdPEDF,行PCR鑒定后,大量擴增并以氯化銫(Cesium chloride,Cscl)梯度法純化,并檢測重組腺病毒滴度。(2)檢測PEDF在真核細胞中的表達。以AdPEDF感染體外
3、培養(yǎng)的HepG2細胞,1h后更換為等量無血清培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h后收集上清,同時以未感染AdPEDF的HepG2細胞培養(yǎng)上清作為對照行Western blot檢測PEDF的表達。 結(jié)果:(1)基因測序結(jié)果表明,所克隆的PEDF基因包含了大鼠PEDF基因閱讀框內(nèi)的全部序列,與NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDF mRNA序列(NM-177927)完全一致。成功構(gòu)建了重組腺病毒穿梭載體pDC316/PEDF,測
4、序驗證了其可靠性,以其與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞,應用Cre/loxp位點細胞內(nèi)同源重組方法構(gòu)建AdPEDF,經(jīng)PCR鑒定證實重組腺病毒構(gòu)建成功。大量擴增后進行CsCl梯度離心純化,并行病毒滴度測定,滴度達3.08×10<'10>pfu/mL,滿足了體內(nèi)和體外試驗要求。(2)Western blot結(jié)果顯示感染組細胞上清液有PEDF的表達,對照組沒有PEDF的表達。證明AdPEDF能夠轉(zhuǎn)染真核細胞使其表達PEDF,并分泌到細
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