分泌性表達(dá)人rPA畢赤酵母菌株的構(gòu)建及發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、血栓病是人類面臨的一類主要疾病，包括急性心肌梗塞、腦血栓、肺靜脈血栓、動(dòng)脈血栓和缺血性休克等。其中急性心肌梗塞(AMI)的死亡率高達(dá)30％。 溶纖治療被認(rèn)為是治療血栓病最為有效的方法。尋找、研制效果好、副作用小的治療藥物一直是世界范圍的熱門課題。其中占中心地位的是纖溶酶原激活劑(plasminogenactivator簡(jiǎn)稱PA)，PA作為溶血栓藥物的機(jī)理在于它能激活血纖溶酶原(plasminogen簡(jiǎn)稱Pg)成為血纖溶酶(pla

2、smin)，后者能夠降解構(gòu)成血栓骨架的血纖蛋白(fibrin)，從而消除血栓。 所謂溶纖能力包括了藥物溶解血栓的速率、徹底性和再栓塞發(fā)生率等方面。一個(gè)好的溶纖劑能夠溶解陳舊或新鮮的血栓，再栓塞率低。 國(guó)內(nèi)、外進(jìn)入臨床應(yīng)用和正在研制的溶纖藥物基本分為三代：第一代溶栓劑包括鏈激酶(SK)和尿激酶(UK)，它們雖然具有較好的溶栓效果，但缺少纖維蛋白的選擇性，除了能激活血栓表面的纖溶酶原外也能激活血漿中游離的纖溶酶原。使α2-抗

3、纖溶酶大量消耗及纖維蛋白原降解，引起全身出血性副作用。 第二代溶栓劑包括組織纖溶酶原激活劑(t-PA)，尿激酶原(Pro-UK)等。t-PA和Pro-UK在體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都有明顯的纖維蛋白親和性，出血性副作用較小，體外無溶栓活性，進(jìn)入血液后，與纖維蛋白結(jié)合后發(fā)生脫?；夥磻?yīng)，形成有活性的SK-纖溶酶原復(fù)合物，激活纖溶酶原。但存在體內(nèi)半衰期短，給藥時(shí)間長(zhǎng)，再栓率高等缺點(diǎn)。 第三代溶栓藥物包括TNK-PA，STAR，rP

4、A等以及正在研制的一些新型溶栓劑。它們基本具備以下特點(diǎn)：溶栓能力強(qiáng)，出血性副作用低，在血液中的半衰期長(zhǎng)，總使用劑量少，治療費(fèi)用低等。 第一代溶栓藥物具有自身難以克服的缺陷，如出血、副作用大等，已被淘汰。第二代溶栓劑已有所改進(jìn)，但還不理想。目前國(guó)際上正在致力于用蛋白質(zhì)工程手段開發(fā)第三代溶栓劑。研究方向是在增強(qiáng)或保持其催化活性前提下，通過對(duì)某些特定氨基酸殘基的突變或是通過相關(guān)結(jié)構(gòu)域的刪除、增加或融合等手段，達(dá)到以下目標(biāo)：1.提高對(duì)纖

5、維蛋白的選擇性；2.提高對(duì)纖溶酶原激活劑抑制劑的抗性；3.延長(zhǎng)其在血液循環(huán)中的半衰期；4.增強(qiáng)其溶栓能力。rPA是由t-PA經(jīng)基因工程改造的缺失突變體，僅包括t-PA的Kringle-2和蛋白酶區(qū)，其主要優(yōu)點(diǎn)是延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期，減少了血液清除率，降低了出血性等副作用。被公認(rèn)為是安全、有效的溶栓藥物。 目前國(guó)內(nèi)尚沒有rPA上市，而國(guó)外上市的rPA是通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得，表達(dá)產(chǎn)物含355個(gè)氨基酸的非糖基化單鏈分子，分子量約39k

6、D，含9對(duì)二硫鍵，多以包涵體形式存在，產(chǎn)品提取和純化過程需經(jīng)過復(fù)雜的變、復(fù)性條件，多二硫鍵極易形成錯(cuò)配和不穩(wěn)定，純化過程回收率往往低于表達(dá)量的10％。此外大腸桿菌細(xì)胞壁脂多糖是藥品內(nèi)毒素的主要來源，rPA單劑用量通常又是其它重組蛋白如rhG-CSF，INFα-2b單劑用量的30倍以上，因而產(chǎn)品要求純度高，內(nèi)毒素含量低，這無疑又加大了下游純化工藝的難度，增加藥物成本。為克服上述缺點(diǎn)，尋求新的表達(dá)系統(tǒng)是急需解決的問題之一。巴氏畢赤酵母(Pi

7、chiapastoris)是一種甲醇酵母，其細(xì)胞過氧化物酶中含甲醇代謝途徑必需的醇氧化酶。AOX1為強(qiáng)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，受甲醇誘導(dǎo)，易于調(diào)控外源基因表達(dá)，并且表達(dá)效率高。巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)作為真核生物，能對(duì)外源真核生物基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行正確翻譯和翻譯后加工。甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母與分泌型酵母表達(dá)質(zhì)粒整合重組，已成功分泌表達(dá)許多外源蛋白。本文通過PCR擴(kuò)增得到(rPA)基因片斷，將該基因片斷插入到含有AOX1啟動(dòng)子和α分泌性信號(hào)

8、肽序列載體pPIC9K中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/rPA，轉(zhuǎn)化PichiapastorisGS115宿主菌。通過比較轉(zhuǎn)化子在MM和MD平板上的生長(zhǎng)狀況，篩選His+Muts表型轉(zhuǎn)化子。并在2.0mg/mLG418平板上篩選得到多拷貝轉(zhuǎn)化子GR10，GR11。搖瓶培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析，結(jié)果表明重組蛋白分子量約39kD，能與特異性單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)；采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)