畢赤酵母表達重組人血清白蛋白(rHSA)的條件優(yōu)化試驗研究.pdf

1、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)占人血漿總蛋白的60％，具有抗凝血、清除自由基、維持血液正常的滲透壓等功能，廣泛用于抗休克與治療燒傷、手術(shù)或意外大出血造成的急性血容量減少。目前市售HSA均來源于人源血漿的提純，存在產(chǎn)量不足以及純化過程難以避免血源病毒兩大問題。因此，利用基因工程技術(shù)來生產(chǎn)重組人血清白蛋白(recombinant HSA，rHSA)代替人源HSA已經(jīng)成為一種趨勢。目前的難點主要集中于提高rHS

2、A的表達水平及其純度。本文針對畢赤酵母(Pichia pastoris)在表達rHSA過程中常用的載體-菌株組合及不同規(guī)模下影響蛋白表達水平的條件進行了初步優(yōu)化試驗研究。
　　本文研究不同載體-菌株組合對rHSA表達水平的影響時發(fā)現(xiàn)：在表達rHSA時，pPICZα系列載體作為表達載體；而選用X-33菌株的rHSA表達水平要優(yōu)于GS115和SMD1168菌株，說明選用X-33作為宿主菌有利于提高rHSA的表達量。
　　本文研究

3、1L搖瓶規(guī)模下不同因素對rHSA表達水平的影響時發(fā)現(xiàn)，不同裝液量、轉(zhuǎn)速、溫度、pH、甲醇濃度和添加次數(shù)以及不同離子對rHSA表達水平均有影響。最佳表達條件為1L三角瓶中裝入100mLBMGY培養(yǎng)基，接種量1％，轉(zhuǎn)速200rpm，pH=5.5，溫度22℃，甲醇每24h添加2次，每次添加量為總體積的1％，磷酸鹽濃度100mM/L，硫酸銨濃度0.5％。最佳表達條件下，誘導240h后rHSA的表達量可達到0.5g/L。此一系列條件可以作為發(fā)酵罐

4、規(guī)模培養(yǎng)條件的參考。
　　本文研究3L發(fā)酵罐規(guī)模下不同因素對rHSA表達水平的影響時發(fā)現(xiàn)，不同的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、起始誘導密度、溶解氧體積分數(shù)(DO)、pH、溫度、甲醇濃度等培養(yǎng)條件以及誘導過程中添加額外碳源、油酸等影響因素對rHSA表達水平均有影響。最佳表達條件為一級種子以10％的接種量接入基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，起始誘導密度為400，發(fā)酵過程中保持DO在30％，誘導溫度22℃，pH=5.75，甲醇電極控制甲醇濃度在1％，誘導過程中添加甘油