HIF-1alpha對周期性張應(yīng)力誘導的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用研究.pdf

1、目的：
　　骨髓間充質(zhì)干細胞分離于低氧環(huán)境下的骨髓（含氧1～7％），缺氧誘導因子-1 alpha(hypoxia-inducible factor1 alpha，HIF-1 alpha)是低氧適應(yīng)病理反應(yīng)中的一個特異的調(diào)節(jié)因子和缺氧誘導條件下基因轉(zhuǎn)錄過程中信息傳遞的共同通路。在機體適應(yīng)缺氧環(huán)境的過程中，HIF-1 alpha起著關(guān)鍵的作用。正畸過程中施加的機械力在牙槽骨和牙根之間造成局部的缺氧環(huán)境，而局部微環(huán)境缺氧是啟動骨改建的重

2、要因素之一。然而，力環(huán)境下HIF-1 alpha對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響是一個重要研究課題，其作用機理不明，國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。綜觀此領(lǐng)域的現(xiàn)有工作:目前關(guān)于周期性張應(yīng)力介導下HIF-1 alpha對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用的研究還很不充分，對周期性張應(yīng)力介導下HIF-1 alpha對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的作用機理的闡述有利于指導臨床醫(yī)生采用不同的手段和方法調(diào)控或誘導骨改建，對臨床干預具有重要的指導意義，這正是實現(xiàn)正畸

3、牙齒最優(yōu)化移動亟需解決的問題。
　　本研究首先擬建立大鼠單側(cè)上頜正畸牙齒移動模型，體內(nèi)實驗檢測HIF-1alpha在受力區(qū)域的表達變化，研究牽張環(huán)境下牙槽骨中HIF-1 alpha的表達水平;同時進行大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)，構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)-力學刺激模型，施加相同頻率，不同力值大小和持續(xù)時間的動態(tài)張應(yīng)力刺激，根據(jù)張應(yīng)力力值和時間與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化之間的關(guān)系，篩選出促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的最適張

4、應(yīng)力;并在此基礎(chǔ)上，采用慢病毒包裝質(zhì)粒構(gòu)建沉默表達HIF-1 alpha的穩(wěn)定細胞系，對其施以最適成骨的張應(yīng)力刺激，研究HIF-1 alpha在周期性張應(yīng)力介導的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化中的作用，并推測其可能的調(diào)控機制;明確力、HIF-1 alpha、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化三者之間的關(guān)系。本課題試圖闡明力學因素在調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的重要作用，從細胞力學角度揭示HIF-1 alpha在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞

5、成骨分化過程中的作用機制，為臨床正畸矯治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.觀察牽張力環(huán)境下牙槽骨中HIF-1 alpha的表達變化:
　　成功地建立大鼠上頜單側(cè)正畸牙移動模型，分別在未加力、加力1d、3d、7d、14d、28d時，處死大鼠，經(jīng)組織固定、脫鈣后，制作上頜右側(cè)第一磨牙牙周組織切片，行HE染色觀察其牙周組織形態(tài)學變化，免疫組織化學進行半定量分析HIF-1 alpha和其下游基因VEGF的表達。本實驗發(fā)現(xiàn)在正

6、常大鼠的牙周組織中基本上未見有明顯的HIF-1 alpha的陽性表達，其下游靶基因VEGF表達也較弱;在正畸加力組中可見HIF-1 alpha的表達增強，并且表達強度變化貫穿正畸牙周組織改建的全過程，靠近牙骨質(zhì)和牙槽骨表面的牙周膜區(qū)域強陽性表達，中間部分的牙周膜也呈陽性表達; VEGF表達雖不如HIF-1 alpha的強，但也隨加力時間延長有增強趨勢。從而確定HIF-1 alpha參與了大鼠牙齒移動過程中牙周組織的改建，在正畸牙移動的機

7、制中具有重要意義。
　　2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定:
　　將全貼壁法分離的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞通過體外分離培養(yǎng)、傳代擴增的方式獲得原代大鼠BMSCs。對細胞進行了形態(tài)學檢驗，MTT法檢測其增殖能力，LIVE/DEAD法檢測細胞的活力，有限稀釋法結(jié)晶紫染色證明其克隆形成能力;并將細胞分別用成骨誘導液及成脂誘導液培養(yǎng)，通過茜素紅染色、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色及油紅O染色

8、證明其多向分化能力。從而對得到的大鼠BMSCs進行細胞活性及干性的鑒定。
　　3.確定最適體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的周期性張應(yīng)力條件:成功的構(gòu)建了大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)-周期性張應(yīng)力加載力學刺激模型，并將細胞分為不加力組和加力組，其中加力組按1％、5％、15％的不同作用力值，以及0.5h、2h、6h、8h、12h的不同持續(xù)時間分為15組，分別施加周期性張應(yīng)力，作用力頻率均為1Hz。加力結(jié)束后對細胞進行ALP堿性磷

9、酸酶活性檢測，根據(jù)OD值篩選出最適宜大鼠BMSCs成骨分化的加力條件為1Hz頻率、5％拉伸強度，并加載6h。
　　4.觀察周期性張應(yīng)力加載下大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)HIF-1 alpha在mRNA和蛋白水平的表達變化:
　　在體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs內(nèi)HIF-1 alpha表達很弱，但經(jīng)周期性張應(yīng)力刺激可促進其在mRNA和蛋白水平的表達，且隨加力時間延長表達增強，mRNA水平表達變化與蛋白水平表達變化呈現(xiàn)較為一致的趨勢。表明H

10、IF-1 alpha可對力學刺激做出陽性表達反應(yīng)。
　　5.穩(wěn)定沉默表達HIF-1alpha的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的構(gòu)建及鑒定:
　　本實驗首先根據(jù)大鼠HIF-1alpha基因序列設(shè)計了四個shRNA干擾靶點，并根據(jù)其基因序列設(shè)計并合成了四對含干擾序列的寡聚單鏈DNA，然后將其退火成雙鏈，插入shRNA慢病毒載體中，構(gòu)建四個shRNA慢病毒重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5 alpha，經(jīng)測序鑒定均為陽性克隆。之后進行慢病毒

11、包裝，病毒原液的收集和超濾濃縮，以及病毒滴度的測定。最后，用包裝好的四組shRNA慢病毒以及陰性對照的慢病毒分別感染大鼠BMSCs，通過Western Blotting評價干擾載體對靶基因的干擾效果，再向沉默表達HIF-1alpha的大鼠BMSCs再次轉(zhuǎn)染HIF-1alpha質(zhì)粒，造成目的基因的過表達，通過Western blotting驗證靶基因的回復效應(yīng)，表明本實驗的結(jié)果不是由于脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的。選擇沉默效果最好的shRNA4感染后的

12、靶細胞構(gòu)建穩(wěn)定株，對穩(wěn)定株細胞進行細胞增殖活性及成骨分化能力鑒定均成功。
　　6.觀察HIF-1 alpha在周期性張應(yīng)力大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的作用:
　　對正常細胞、沉默表達HIF-1 alpha的細胞、陰性對照感染的細胞分別進行最適力值的刺激，即加載1Hz頻率、5％拉伸強度的周期性張應(yīng)力6h，采用qPCR和Western blotting檢測三組細胞加力后的ALP活性，及成骨樣基因骨鈣素(Osteocalc

13、in，OCN)、骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）、骨涎蛋白(Bone sialoprotein，BSP)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor2，RUNX2）、Osterix基因的mRNA和蛋白表達變化。正常大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞表達ALP，沉默表達HIF-1 alpha后，ALP表達活性升高(P＜0.05)，但對照組細胞ALP表達未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。正常大鼠骨髓間充

14、質(zhì)干細胞有OCN、OPN、BSP、RUNX2、Osterix的mRNA和蛋白表達，沉默表達HIF-1 alpha后，OCN、OPN、BSP、RUNX2、Osterix的mRNA和蛋白表達均升高(P＜0.05)，但對照組細胞OCN、OPN、BSP、RUNX2、Osterix的mRNA和蛋白表達未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。
　　同時檢測細胞HIF-1 alpha，及其下游基因VEGF和TWIST的mRNA和蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)正常大

15、鼠骨髓間充質(zhì)干細胞有VEGF、TWIST和HIF-1 alpha的mRNA和蛋白表達，沉默表達HIF-1 alpha后VEGF和TWIST的表達量也有所減少(P＜0.05)，但對照組細胞未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。推測成骨樣因子的變化可能與HIF-1 alpha下游基因VEGF和TWIST有關(guān)，但具體機制仍需進一步驗證。
　　結(jié)論：
　　1.HIF-1 alpha在大鼠單側(cè)上頜牙齒移動模型中的表達有明顯變化，從而確定其參

16、與了大鼠牙齒移動過程中牙周組織的改建，在正畸牙齒移動的機制中具有重要意義。
　　2.周期性張應(yīng)力刺激可誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外成骨向分化，最適加力條件為1Hz頻率、5％拉伸強度，并加載6h。在該過程中HIF-1 alpha在mRNA及蛋白水平的表達均增強，且隨加力時間延長表達增強，表明HIF-1 alpha可對力學刺激作出陽性反應(yīng)，從細胞水平證實HIF-1 alpha參與了力環(huán)境下成骨分化的過程。
　　3.沉默表達HIF