eIF4E在鼻咽癌中的轉(zhuǎn)錄活化機制及其對腫瘤細胞增殖侵襲的調(diào)控作用.pdf

1、鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC）由于與EB病毒感染關(guān)系密切而成為獨特的頭頸部腫瘤，具有轉(zhuǎn)移早（初診轉(zhuǎn)移率約60％）、易復(fù)發(fā)及5年生存率低下（50％以下）等臨床特點，其中易轉(zhuǎn)移的特性是危害廣大患者生命健康的根本原因之一。然而鼻咽癌的易轉(zhuǎn)移的分子機制，目前尚不完全清楚，近年來一直是腫瘤學(xué)研究的熱點之一。
　　新癌基因eIF4E（eukaryotictranslationinitiationfactor4

2、E，真核翻譯起始因子4E）作為蛋白質(zhì)翻譯的關(guān)鍵因子，在翻譯起始階段對眾多癌基因和生長因子的蛋白翻譯起限速作用。eIF4E的異?；罨蛇x擇性啟動癌基因mRNA翻譯表達。已有臨床研究報道eIF4E在肺癌、乳腺癌、食管癌等多種腫瘤組織中表達升高，并與這些腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。我們的前期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組織中eIF4E高表達，提示eIF4E與鼻咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。章俊等在組織標本中采用免疫組化的方法初步研究發(fā)現(xiàn)eIF4E在鼻咽癌組織

3、中高表達，并與LMP1的表達呈正相關(guān)，與患者5年生存率呈反比。本課題組對全球718例鼻咽癌的Meta分析證實LMP1導(dǎo)致鼻咽癌轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上，本課題組在鼻咽癌CNE2細胞中轉(zhuǎn)染LMP1表達質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)eIF4E基因mRNA表達水平升高。因此，我們假設(shè)：“eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化，進而促進鼻咽癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移?！逼裎匆娤嚓P(guān)研究報道。
　　相對于轉(zhuǎn)錄水平，蛋白翻譯水平的調(diào)控對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展更為直接有效。而鼻咽癌的癌

4、蛋白翻譯水平調(diào)控研究目前報道較少，尤其是源頭癌基因LMP1作為跨膜轉(zhuǎn)化蛋白如何將相關(guān)促癌信號轉(zhuǎn)變?yōu)橐幌盗邪┗虻姆g表達，進而引起鼻咽癌細胞生物學(xué)行為的改變，亟待更多更深入的研究。因此，本論文將就鼻咽癌細胞中eIF4E受LMP1轉(zhuǎn)錄活化的機制，eIF4E轉(zhuǎn)錄活化對于鼻咽癌增殖侵襲的調(diào)控作用進行初步探討，以期為闡明鼻咽癌易轉(zhuǎn)移機制提供新的研究思路，為臨床監(jiān)控鼻咽癌患者預(yù)后提供新的檢測指標和治療靶點。
　　【目的】
　　1.研究

5、eIF4E在鼻咽癌細胞中高表達的機制。
　　2.研究eIF4E在鼻咽癌細胞中被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化的機制。
　　3.研究eIF4E的轉(zhuǎn)錄活化對鼻咽癌細胞增殖和侵襲的影響。
　　【方法】
　　1.細胞株：CNE1（高分化鼻咽癌細胞株，EBV陰性），CNE2（低分化鼻咽癌細胞株，初建時EBV陽性），B95-8細胞（EB病毒感染的永生化絨猴外周血淋巴細胞株，EBV陽性，LMP1強陽性表達），以CNE1和CNE2細胞為研

6、究對象，B95-8細胞為對照。
　　2.實驗方法
　?。?）通過基因重組方法構(gòu)建含eIF4E啟動子的pGL3Basic-eIF4E重組質(zhì)粒、eIF4E全長表達重組質(zhì)粒、eIF4EshRNA重組質(zhì)粒，LMP1shRNA重組質(zhì)粒，c-myc-siRNA載體。
　?。?）利用qPCR實驗檢測鼻咽癌細胞及B95-8細胞中eIF4E、LMP1、c-mycmRNA表達水平。
　?。?）利用WesternBlotting實驗檢

7、測LMP1轉(zhuǎn)染對鼻咽癌細胞eIF4E蛋白表達水平的影響。
　　（4）利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測eIF4E基因啟動子活性。
　?。?）采用RNAi和慢病毒包裝技術(shù)，構(gòu)建eIF4E干擾慢病毒顆粒，并借助慢病毒感染實驗和穩(wěn)定干擾細胞篩選實驗，構(gòu)建穩(wěn)定干擾eIF4E的鼻咽癌細胞株及對照細胞株。
　?。?）采用CCK8增殖實驗、流式細胞術(shù)、細胞運動實驗和侵襲實驗，檢測eIF4E轉(zhuǎn)錄異常對鼻咽癌細胞增殖、運動和侵襲活性的影響。

8、
　　【結(jié)果】
　　1.eIF4E被LMP1顯著誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化
　　1.1LMP1轉(zhuǎn)染可促進eIF4EmRNA的表達
　?、貺MP1瞬時轉(zhuǎn)染CNE1細胞，實驗組出現(xiàn)LMP1表達，eIF4E基因的mRNA表達水平隨之顯著上調(diào)，是對照組的1.6倍（P<0.01）。
　?、贚MP1瞬時轉(zhuǎn)染CNE2細胞，實驗組出現(xiàn)LMP1表達，eIF4E基因的mRNA表達水平隨之顯著上調(diào)，是對照組的3.0倍（P<0.01），且比在C

9、NE1細胞中的升高幅度大（P<0.01）。
　?、跮MP1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE1細胞，CNE1/LMP1細胞有LMP1表達，eIF4E基因的mRNA水平是對照組的1.7倍（P<0.01），與瞬時轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果一致。
　　④LMP1表達質(zhì)粒劑量梯度瞬時轉(zhuǎn)染CNE2細胞，實驗組LMP1mRNA水平呈梯度升高，eIF4E基因mRNA水平也伴隨LMP1表達質(zhì)粒劑量梯度升高而升高（P<0.01）。
　　⑤成功構(gòu)建LMP1干擾質(zhì)粒（LMP

10、1-shRNA），干擾效率達65.0％以上。
　?、轗NAi技術(shù)干擾B95-8細胞LMP1表達，LMP1mRNA表達水平下調(diào)70.0％，eIF4E的mRNA表達水平下調(diào)72.0％。
　　1.2LMP1轉(zhuǎn)染可促進鼻咽癌細胞eIF4E蛋白的表達
　?、貺MP1瞬時轉(zhuǎn)染CNE1細胞，實驗組LMP1蛋白出現(xiàn)表達，eIF4E蛋白表達水平升高，是對照MOCK和vector組的2.8倍（P<0.01），與轉(zhuǎn)錄水平改變一致。
　

11、　②LMP1瞬時轉(zhuǎn)染CNE2細胞，實驗組可測得LMP1蛋白表達，eIF4E蛋白表達水平升高，是對照組的4.7倍（P<0.01），與轉(zhuǎn)錄水平改變一致，且比在CNE1細胞中的升高幅度大（P<0.01）。
　?、跮MP1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CNE1細胞，CNE1/LMP1細胞LMP1蛋白高表達，而eIF4E蛋白表達水平是對照組細胞的3.0倍（P<0.01），與瞬時轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果一致。
　　2.eIF4E在鼻咽癌細胞中被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化的機制

12、
　　2.1LMP1轉(zhuǎn)染可促進鼻咽癌細胞eIF4E啟動子活性升高
　　①成功構(gòu)建含有eIF4E啟動子序列的重組報告基因質(zhì)粒。
　　②瞬時LMP1轉(zhuǎn)染CNE1細胞，eIF4E啟動子活性比對照組增強20.0倍（P<0.01）。
　?、鬯矔rLMP1轉(zhuǎn)染CNE2細胞，eIF4E啟動子活性比對照組增強47.0倍（P<0.01），比在CNE1細胞中的增強效果明顯。
　　2.2在LMP1過表達狀態(tài)下沉默c-myc可明顯降

13、低eIF4E的轉(zhuǎn)錄表達水平
　?、貺MP1在CNE1細胞的穩(wěn)定表達使CNE1/LMP1細胞c-myc和eIF4E基因mRNA水平升高，分別為對照組的8.2和1.8倍（P<0.01）。
　?、诟蓴_LMP1，B95-8細胞的c-myc和eIF4E基因mRNA水平隨LMP1表達降低而下調(diào)，分別比對照組下降54.0％和60.0％（P<0.01）。
　　③在LMP1高表達狀態(tài)下，干擾CNE1細胞c-myc表達，c-myc的mRN

14、A表達下降，隨之eIF4E轉(zhuǎn)錄表達比對照組下降35.0％（P<0.05），LMP1mRNA水平亦降低，比對照組下降30.0％（P<0.05）。
　　2.3eIF4E過表達可導(dǎo)致LMP1的轉(zhuǎn)錄表達水平升高
　　①成功構(gòu)建含有eIF4E全長序列的GFP融合重組質(zhì)粒pEGFPN1-eIF4E。
　　②瞬時轉(zhuǎn)染eIF4E表達質(zhì)粒，CNE1細胞的eIF4E的mRNA水平比對照組升高18.0倍（P<0.01），LMP1基因表達比對

15、照組升高6.0倍（P<0.01）。
　　3eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化對鼻咽癌細胞增殖、運動和侵襲活性的影響
　?、俪晒?gòu)建eIF4E干擾慢病毒顆粒，干擾效率可達70.0％以上。
　?、诔晒?gòu)建穩(wěn)定干擾eIF4E表達70.0％以上的細胞模型（CNE2siEp）及其空載體對照細胞株（CNE2siNC）。
　?、跮MP1瞬時轉(zhuǎn)染CNE1細胞，細胞增殖、運動和侵襲活性分別比對照組升高1.1倍、2.5倍和1.4倍（P

16、<0.05）。
　?、躄MP1瞬時轉(zhuǎn)染CNE2細胞，細胞增殖、運動和侵襲活性分別比對照組升高1.1倍、3.0倍和1.6倍（P<0.05），其中運動和侵襲活性的改變比在CNE1細胞中明顯。
　?、軱MP1在CNE1細胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達，與對照組相比，細胞周期出現(xiàn)異常，G1期細胞比例下降，S期細胞比例增加（P<0.01）；CNE1/LMP1細胞運動和侵襲活性分別比對照組升高1.7倍和1.6倍（P<0.01）。
　?、薹€(wěn)定干

17、擾eIF4E轉(zhuǎn)錄表達，CNE2siEp細胞出現(xiàn)增殖抑制，群體倍增時間延長，G1期阻滯，靜止期細胞（G0/G1）比例升高，DNA合成期（S）細胞比例下降，細胞增殖活性減弱，運動和侵襲活性降低，僅為對照CNE2組的59.0-73.0％（P<0.05）。
　?、咴贚MP1高表達狀態(tài)下，干擾eIF4E后CNE1細胞比對照組的增殖活性下降10.0％（P<0.05），運動活性下降40.0％（P<0.01），侵襲活性降低50.0％（P<0.01

18、）。
　?、嘣贚MP1高表達狀態(tài)下，干擾eIF4E后CNE2細胞比對照組，增殖活性下降10.0％（P<0.05），運動活性下降63.0％（P<0.01），侵襲活性降低37.0％（P<0.01）。
　　【結(jié)論】
　　1.首次發(fā)現(xiàn)eIF4E在鼻咽癌細胞中可被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化，這可能是eIF4E在鼻咽癌中高表達的直接原因。eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致eIF4E蛋白水平升高，提示eIF4E的轉(zhuǎn)錄活化在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中具

19、有重要意義。eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄在低分化鼻咽癌細胞（在臨床上90％鼻咽癌為低分化型，與EBV感染關(guān)系密切）中比在高分化鼻咽癌細胞（僅占臨床鼻咽癌的5％，與EBV感染無關(guān)）中明顯，提示eIF4E的轉(zhuǎn)錄活化參與EB病毒的致癌效應(yīng)。在絨猴淋巴瘤B95-8細胞中eIF4E也可被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，表明eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄在EBV相關(guān)腫瘤中可能普遍存在。
　　2.eIF4E在鼻咽癌細胞中被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化的可能機制是：LM

20、P1通過誘導(dǎo)c-myc表達，c-myc轉(zhuǎn)而結(jié)合eIF4E啟動子，激活eIF4E轉(zhuǎn)錄活化。意外的發(fā)現(xiàn)是，轉(zhuǎn)錄表達eIF4E可提高LMP1mRNA水平，提示eIF4E可誘導(dǎo)LMP1轉(zhuǎn)錄，兩個基因可能形成LMP1/eIF4E正反饋環(huán)，但eIF4E誘導(dǎo)LMP1表達的具體機制不詳，有待進一步研究。
　　3.eIF4E被LMP1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化后可促進鼻咽癌細胞增殖、運動和侵襲，而且對低分化鼻咽癌細胞比高分化鼻咽癌細胞的影響更明顯，對細胞運動和侵