TrKB、VEGF在鼻咽癌中的表達(dá)及其調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)體外研究.pdf

1、第一部分 TrKB及VEGF在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義
　　 目的:
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是來(lái)源于鼻咽上皮組織的高度惡性腫瘤，其預(yù)后與腫瘤的局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血管形成與惡性腫瘤生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移與及預(yù)后密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是人們發(fā)現(xiàn)的重要的血管生成

2、因子，通過(guò)促腫瘤血管生成而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。酪氨酸激酶B(Tyrosine kinase B，TrKB)在腫瘤血管生成及腫瘤生長(zhǎng)，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。本部分研究意在探討VEGF及TrKB在NPC組織中的表達(dá)并比較兩者表達(dá)的相關(guān)性及分析與腫瘤臨床特征的關(guān)系。
　　 方法:
　　 采用免疫組化方法檢測(cè)55例鼻咽癌組織和30例正常鼻咽組織中VEGF及TrKB蛋白表達(dá)水平，比較二者表達(dá)差異。根據(jù)患者年齡、腫瘤臨床

3、分型、原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移將病例分組，應(yīng)用雙變量相關(guān)pearson檢驗(yàn)分析研究VEGF及TrKB表達(dá)與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系
　　 結(jié)果:
　　 1.VEGF蛋白于腫瘤細(xì)胞漿及血管內(nèi)皮細(xì)胞漿中均表達(dá)，TrKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)絕大多數(shù)位于細(xì)胞漿內(nèi)。在55例鼻咽癌中，45例表達(dá)TrKB陽(yáng)性，表達(dá)率為82.1％，47例表達(dá)VEGF陽(yáng)性，表達(dá)率為85.7％。30例正常鼻咽組織中，只有3例表達(dá)TrKB陽(yáng)性，5例表達(dá)

4、VEGF陽(yáng)性，腫瘤組織中TrKB、VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常鼻咽組織(P＜0.05)，鼻咽癌組織中VEGF與TrKB表達(dá)有明顯相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R=0.586，P＜0.05)。
　　 2.VEGF蛋白表達(dá)與NPC的臨床分期(P=0.002)、腫瘤的直徑大小(P=0.009)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)明顯相關(guān)，與患者性別、年齡、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P＞0.05)。TrKB蛋白表達(dá)與臨床分期(P=0.00)、腫瘤的直徑大小(

5、P=0.00)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.006)明顯相關(guān)，與患者性別、年齡、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.VEGF，TrKB在NPC組織中表達(dá)增加，可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān);
　　 2.TrKB可能與鼻咽癌血管形成有關(guān)。
　　 第二部分阻斷BDNF-TrKB通路對(duì)鼻咽癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為影響的體外研究
　　 目的:
　　 探討通過(guò)酪氨酸激酶受體抑制劑K252

6、a抑制TrKB表達(dá)，觀察抑制TrKB表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)遷移、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及對(duì)VEGF表達(dá)的影響。
　　 方法:
　　 分別用不同濃度K252a干預(yù)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)比較不同濃度K252a對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并計(jì)算細(xì)胞生存(增殖)率，篩選出K252a最佳干預(yù)濃度;通過(guò)劃痕愈合試驗(yàn)觀察抑制TrKB表達(dá)后對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)分析抑制T

7、rKB表達(dá)對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　 分別用RT-PCR、Western-blot檢測(cè)K252a干預(yù)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞后VEGF、TrkB在mRNA以及蛋白層面表達(dá)的改變并與對(duì)照組比較差異。
　　 結(jié)果:
　　 MTT實(shí)驗(yàn):K252a能明顯抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞數(shù)量減少、密度減低、細(xì)胞生存率下降，其對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與K252a干預(yù)時(shí)間、濃度呈正相

8、關(guān)。K252a作用48h使鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖率抑制最明顯的濃度為400 nmol/L，細(xì)胞生存減少50％(與對(duì)照組相比)，故選取此濃度為K252a最佳干預(yù)濃度。
　　 劃痕愈合實(shí)驗(yàn):抑制TrKB表達(dá)可使劃痕愈合延遲，使12h鼻咽癌CNE-1細(xì)胞遷移距離明顯小于對(duì)照組，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.18)，使24h小時(shí)細(xì)胞遷移距離細(xì)胞遷移距離明顯少于對(duì)照組(P=0.013)，說(shuō)明抑制TrKB表達(dá)能一定程度上抑制鼻咽癌CNE-1

9、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力。
　　 流式細(xì)胞儀分析:K252a干預(yù)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，與對(duì)照組相比，鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞顯著增多(57.67±7.03 vs73.86±4.22，P=0.018)，而處于S期(30.67±3.68 vs15.37±2.16，P=0.025)的細(xì)胞顯著減少，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)K252a干預(yù)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況，K252a

10、與對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(22.27±3.09 vs3.42±2.56,P=0.01)。
　　 Western blot:K252a干預(yù)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，VEGF蛋白表達(dá)水平下調(diào)(0.6883±0.19 vs0.378±0.44)，TrKB蛋白表達(dá)水平下調(diào)(0.631±0.15 vs0.313±0.28)，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 RT-PCR:K252a干預(yù)鼻咽癌CNE

11、-1細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)TrkB mRNA表達(dá)下調(diào)(0.67±0.37 vs0.435±0.63);VEGF mRNA表達(dá)下調(diào)(0.6883±0.49 vs0.425±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.TrKB表達(dá)抑制可降低鼻咽癌CNE-1細(xì)胞生長(zhǎng)遷移能力;
　　 2.TrKB表達(dá)抑制可通過(guò)促進(jìn)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期改變和降低VEGF表達(dá)，從而減弱生長(zhǎng)與遷移

12、能力;
　　 3.TrKB通過(guò)調(diào)控VEGF影響鼻咽癌血管形成。
　　 第三部分 TrKB調(diào)控鼻咽癌新生血管生成的體內(nèi)研究
　　 目的:
　　 體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)依賴(lài)腫瘤血管生成。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)VEGF通過(guò)誘導(dǎo)血管生成及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂從而促進(jìn)血管形成。研究證實(shí)血管生成、微血管與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系密切，微血管密度(microvesseldensity，MVD)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，且VEGF表達(dá)與MVD的表

13、達(dá)有良好的相關(guān)性。前部分體外實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)K252a能抑制VEGF蛋白和基因水平的表達(dá)，本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立裸小鼠移植瘤模型，探討K252a干預(yù)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞對(duì)人鼻咽癌血管生成抑制作用的體內(nèi)研究，為針對(duì)鼻咽癌抗血管生成基因治療尋找新的思路。
　　 方法:
　　 使用4-6周齡雄性BALB/C-nu/nu裸鼠，體重在16～20g，將人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞于裸鼠右側(cè)季肋部皮下注射，建立荷人鼻咽癌細(xì)胞裸小鼠皮下移植瘤模型

14、。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為2組，A組:K252a干預(yù)組，7只;B組:PBS組，7只;于接種腫瘤細(xì)胞后第6、8、10、12、14天用微量注射器于A組裸鼠腫瘤內(nèi)多點(diǎn)注射K252a藥物，400nmol/L200ul/次，對(duì)兩組移植瘤模型進(jìn)行為期21天的實(shí)驗(yàn)觀察，自第一次注射藥物后每隔2天測(cè)量1次裸鼠腫瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
　　 于接種后第21天處死，剝離腫瘤標(biāo)本，測(cè)量最后體積，觀察標(biāo)本整體特征。取出部分組織的標(biāo)本于固定于10％福爾馬林

15、溶液中，于我院病理科常規(guī)石蠟包埋后行連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色、VEGF、TrKB和CD31相關(guān)抗原免疫組化染色。
　　 結(jié)果:
　　 1.中瘤標(biāo)本大體形態(tài)及HE染色觀察:2組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成瘤均于接種后第4天。兩組腫瘤與周?chē)M織分界清楚，包膜基本完整。K252a干預(yù)組治療組皮下腫瘤瘤體較小，呈不規(guī)則球形，也有的呈分葉狀，表面灰白色，質(zhì)地較硬。剖面呈白色，剖面滲血較少。對(duì)照組腫瘤瘤體較K252a組明顯增大，表面多不平，有分葉狀

16、結(jié)節(jié)狀，表面豐富血管形成，剖面滲血較多;
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤體體積觀察: K252a干預(yù)組從給藥開(kāi)始，腫瘤生長(zhǎng)緩慢，第21天腫瘤瘤體體積為(328+326.7) mm3，同期對(duì)照組為(1044+818) mm3;
　　 3.兩組CD31標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)與VEGF、TrKB染色評(píng)分對(duì)比及相關(guān)性分析
　　 K252a干預(yù)組和對(duì)照組陽(yáng)性血管計(jì)數(shù)分別為22.39±4.72、49.79±11.12，方差分析各組間差別具有

17、顯著性(P＜0.05)。K252a干預(yù)組VEGF表達(dá)明顯比對(duì)照組下降，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(7.57+2.82 vs9.86±2.79，P=0.007)，K252a干預(yù)組明顯比對(duì)照組TrKB表達(dá)下降，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5.8571±2.79 vs7.43±2.64，P=0.005)，各組VEGF表達(dá)與MVD明顯相關(guān)(對(duì)照組:r=0.88，P=0.009，K252a組:r=0.96，P=0.01)，MVD與TrKB表達(dá)明顯正相關(guān)(對(duì)照組:r=0.