eIF4E在人非小細(xì)胞肺癌中的作用及其對(duì)Pim-1表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率及死亡率位于常見惡性腫瘤的前列，揭示其病因及發(fā)病機(jī)制對(duì)于肺癌的有效治療意義重大。我們前期研究表明，Pim-1在非小細(xì)胞肺癌組織(Non-small-cell lung cancer, NSCLC)中過表達(dá)，并且其過表達(dá)可以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖以及腫瘤遷移等過程，發(fā)揮癌基因的作用。但是，目前有關(guān)Pim-1在NSCLC中過表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eIF4E)作為重要的真核細(xì)胞翻譯起始

2、因子，可增加一些癌基因在蛋白水平的合成過程。eIF4E是否參與NSCLC中Pim-1的表達(dá)調(diào)控尚不清楚。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究eIF4E在NSCLC中的表達(dá)及作用，同時(shí)分析eIF4E對(duì)Pim-1表達(dá)的調(diào)控作用。
　　方法:
　　1、免疫組織化學(xué)方法
　　采用免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus三步法，檢測(cè)Pim-1與eIF4E蛋白在福爾馬林固定石蠟包埋NSCLC組織中的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，分析Pim-1與eIF4E

3、表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，并對(duì)二者表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　2細(xì)胞培養(yǎng)
　　人肺癌細(xì)胞H1299、A549、H157、H460和H358，培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶+0.02％ EDTA消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代以及細(xì)胞的收集，進(jìn)行相關(guān)研究。
　　3 siRNA轉(zhuǎn)染
　　

4、使用100 pmol eIF4E特異性siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H1299和A549細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染Negtive control siRNA(NC siRNA)作為陰性對(duì)照。體外觀察eIF4E在NSCLC中的作用及對(duì)Pim-1的表達(dá)的影響。
　　4 MTT比色法
　　分別于eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染后0h、24 h、48h、72h和96h，采用MTT方法檢測(cè)對(duì)H1299及A549細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;不同濃度吉非替尼處理48h后進(jìn)行MTT

5、檢測(cè)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。此外，分別于Pim-1 siRNA或eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合吉非替尼(gefitinib)處理細(xì)胞后進(jìn)行MTT檢測(cè)。
　　5蛋白免疫印跡(Western blot)
　　eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染H1299、A549細(xì)胞48h后提取細(xì)胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染后eIF4E和Pim-1蛋白表達(dá)情況，并計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。采用Odysse

6、y儀器進(jìn)行顯色分析，Bio-LD圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。
　　6 Real-time PCR
　　轉(zhuǎn)染處理H1299和A549細(xì)胞48h后，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中Pim-1和eIF4E mRNA的表達(dá)情況。采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(△△Ct)方法計(jì)算，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　7統(tǒng)計(jì)
　　應(yīng)用SPSS Statistics17.0

7、軟件，數(shù)據(jù)分析采用兩樣本t檢驗(yàn)、x2檢驗(yàn)、spearman等級(jí)相關(guān)分析及曲線擬合;計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±SD）表示。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 eIF4E蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，eIF4E蛋白的陽性著色定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿中。在69例NSCLC石蠟組織中有56例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為81.1％(56/69)。進(jìn)一步分析發(fā)

8、現(xiàn)，eIF4E蛋白的表達(dá)與腫瘤大小密切相關(guān)(P=0.036)，但是與其他重要臨床病理特征無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。
　　2 eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移的影響
　　體外培養(yǎng)A549和H1299細(xì)胞，將eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，從細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移方面觀察eIF4E在NSCLC中可能的作用。
　　2.1 eIF4E siRNA干擾效率的檢測(cè)
　　我們選取eIF4E蛋白高表達(dá)的A549

9、和H1299細(xì)胞進(jìn)行eIF4E siRNA干擾實(shí)驗(yàn)，于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行干擾效率的檢測(cè)。Real-time PCR結(jié)果顯示，與NC siRNA對(duì)照組相比，eIF4E mRNA的表達(dá)在A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中分別降低了83％和80％。 Western blot檢測(cè)結(jié)果同樣表明，eIF4E蛋白的表達(dá)在eIF4EsiRNA轉(zhuǎn)染組明顯低于對(duì)照組。上述結(jié)果表明，所用eIF4E siRNA序列可以有效干

10、擾eIF4E的表達(dá)。
　　2.2 eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響
　　MTT檢測(cè)結(jié)果表明，A549及H1299細(xì)胞的存活率在eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染后48h、72h和96h時(shí)均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），并且隨著時(shí)間增加抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用越明顯。結(jié)果提示，敲低eIF4E表達(dá)可抑制A549和H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　2.3 eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞遷移力的影響
　　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

11、明，于劃痕后48h，可見eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染組A549和H1299細(xì)胞朝向劃痕遷移的速度明顯低于對(duì)照組細(xì)胞。結(jié)果表明敲低eIF4E表達(dá)可抑制細(xì)胞的遷移能力。
　　3 eIF4E對(duì)體外培養(yǎng)A549和H1299細(xì)胞Pim-1表達(dá)的影響
　　為進(jìn)一步探討eIF4E對(duì)Pim-1在肺癌中表達(dá)的作用，我們采用siRNA干擾技術(shù)，將eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞，從RNA和蛋白水平上對(duì)二者表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行研究。

12、r>　　Real-time PCR結(jié)果顯示，與NC siRNA對(duì)照組相比，eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染組A549和H1299細(xì)胞中Pim-1在mRNA水平的表達(dá)無顯著變化。但是，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，Pim-1蛋白的表達(dá)在eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染組明顯低于對(duì)照組，尤其A549細(xì)胞下降更為明顯。結(jié)果提示，敲低eIF4E表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞中Pim-1蛋白的表達(dá)。
　　4 eIF4E與Pim-1蛋白在NSCLC組織中表達(dá)

13、的相關(guān)性分析
　　4.1 Pim-1蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，Pim-1蛋白的陽性著色部位定位于腫瘤細(xì)胞胞核和（或）胞漿。在77例NSCLC組織中有51例陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為66.2％(51/77)，21例正常肺組織中僅有3例陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為14.3％(3/21)，表明腫瘤組織中Pim-1蛋白的表達(dá)顯著高于正常組織（P＜0.001）。并且Pim-1蛋白的表達(dá)和腫

14、瘤組織學(xué)類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)(P＜0.05)。
　　4.2 Pim-1蛋白和eIF4E蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析
　　在69例NSCLC標(biāo)本中，Pim-1和eIF4E共同陽性例數(shù)有43例，共同陰性有11例。利用spearman等級(jí)相關(guān)分析(Spearman's rank test)發(fā)現(xiàn)，二者表達(dá)具有顯著的正性相關(guān)關(guān)系（r=0.504， P＜0.001）。
　　5 eIF4E/Pim-1 si

15、RNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對(duì)A549和H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　5.1繪制gefitinib對(duì)A549和H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
　　采用MTT檢測(cè)并利用曲線擬合(curve fitting)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值確定gefitinib最適的作用濃度。結(jié)果表明，gefitinib對(duì)H1299、A549細(xì)胞的IC50分別為20.17μM和10.56μM，所以我們分別用20μM和10μM處

16、理H1299和A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　5.2 eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　MTT檢測(cè)結(jié)果表明，A549細(xì)胞給予eIF4E siRNA聯(lián)合gefitinib處理后72小時(shí)，可見細(xì)胞存活率顯著低于NC siRNA聯(lián)合gefitinib處理組細(xì)胞（P＜0.05）。此外，給予H1299細(xì)胞eIF4E siRNA聯(lián)合gefitinib處理后48h和72h，均可見細(xì)胞存活率顯著低于N

17、C siRNA聯(lián)合gefitinib處理組（P＜0.05）。上述結(jié)果提示eIF4E siRNA轉(zhuǎn)染可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向治療藥物gefitinib的敏感性。
　　5.3 Pim-1 siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合gefitinib處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　MTT檢測(cè)結(jié)果表明，A549細(xì)胞給予Pim-1 siRNA聯(lián)合gefitinib處理后48h和72小時(shí)，可見細(xì)胞細(xì)胞存活率顯著低于NC siRNA聯(lián)合gefitinib處理組細(xì)胞(P＜

18、0.05)。此外，給予H1299細(xì)胞給予Pim-1 siRNA聯(lián)合gefitinib處理72h，均可見細(xì)胞存活率顯著低于NC siRNA聯(lián)合gefitinib處理組(P＜0.05)。上述結(jié)果提示Pim-1 siRNA轉(zhuǎn)染可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)gefitinib的敏感性。
　　結(jié)論:
　　1、eIF4E蛋白在人非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)，并且其表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)。體外敲低eIF4E表達(dá)可顯著抑制A549和H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)與