SiRNA干擾EIF4G1表達對鼻咽癌生長侵襲影響.pdf

1、研究背景和目的: 鼻咽癌（NasoPharyngeal Carcinoma，NPC）是一種主要發(fā)生在我國南方地區(qū)的鼻咽部惡性腫瘤，由于NPC發(fā)生的部位比較隱蔽，早期癥狀常不明顯而容易被忽略，因此確診的患者60%以上都是中、晚期病例，常伴有轉移發(fā)生。尋找鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及轉移的機制，是我們當前研究的主要方向。 腫瘤的形成和侵襲轉移是一個多步驟、多階段、多因子參與的復雜而又連續(xù)的過程，涉及了一些關鍵的癌基因和抑癌基因。在前期研

2、究中，我們利用cDNA微陣列檢測了鼻咽癌組織、混合的鼻咽癌細胞（5-8F、6-10B和CNE2）與非癌鼻咽組織間的差異表達基因，經BRB軟件分析，真核翻譯起始因子（eukaryotic translation initiation factors，EIFs）EIF4G1在鼻咽癌組織和細胞中表達明顯上調，提示該基因可能正向參與促進了鼻咽癌的發(fā)病過程。 EIF4G1作為一個“支架蛋白”，使其它與翻譯起始有關的因子與之結合而發(fā)揮各自

3、的作用。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表明，EIF4G1除了促進蛋白翻譯外，也與腫瘤的發(fā)生、進展密切相關。該基因有報導在喉癌、肺癌、乳腺癌中表達明顯增高，促進了腫瘤細胞蛋白翻譯、腫瘤血管生成、細胞惡性轉化和抗凋亡。 為了闡明/EIF4G1基因在鼻咽癌發(fā)病中的作用，我們利用RNAi技術高效、特異的靶向沉默機制干擾鼻咽癌細胞5-8F中EIF4G1表達，建立穩(wěn)定靶向干擾EIF4G1表達的siRNA鼻咽癌細胞，以觀察干擾EIF4G1后，鼻咽癌

4、生物學功能改變，為鼻咽癌的發(fā)病機制和治療提供新的思路。 方法: 1. EIF4G1在鼻咽癌中的表達特性鑒定。 免疫組化SP法從蛋白水平檢測EIF4G1在非癌鼻咽炎組織和鼻咽癌中的表達水平，初步探討EIF4G1在組織水平與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關系。 熒光定量PCR法從mRNA水平檢測EIF4G1在永生化鼻咽上皮細胞NP69和鼻咽癌細胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、

5、SUNE1中的表達水平，初步探討EIF4G1在永生化鼻咽上皮細胞和鼻咽癌細胞中的表達差異，并找到高表達EIF4G1的鼻咽癌細胞作為下一步干擾對象。 2.EIF4G1表達沉默對鼻咽癌細胞生物學影響。 構建EIF4G1慢病毒干擾、陰性對照載體，包裝成成熟的慢病毒顆粒感染高表達EIF4G1的5-8F細胞，篩選出穩(wěn)定的陽性和空載克隆，熒光定量PCR檢測各干擾克隆細胞中EIF4G1干擾效率，篩選干擾效率最高的細胞克隆。在weste

6、rn-blot驗證干擾后EIF4G1蛋白表達水平后，該細胞克隆作為實驗對象被進一步研究。MTT法、流式細胞術及平板克隆形成實驗檢測EIF4G1沉默后對細胞體外增殖的影響；Transwell和boyden小室分別檢測EIF4G1沉默后細胞遷移運動和侵襲能力的改變；裸鼠皮下移植瘤實驗來觀察EIF4G1沉默后裸鼠體內成瘤能力的影響。 3.統(tǒng)計學方法。 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，第一章中因免疫組化各指標均為等

7、級資料，故其組間的比較采用非參數(shù)秩和檢驗，EIF4G1的表達在非癌鼻咽組織和鼻咽癌比較采用Mann-Whitney U檢驗；EIF4G1的表達與鼻咽癌病理分化的關系檢驗用Kruskal Wallis Test，檢驗水準均取雙側α=0.05；熒光定量PCR法檢測鼻咽癌細胞株EIF4G1表達特性結果比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK檢驗。第二章中熒光定量PCR、運動、侵襲實驗、平板克隆形成實驗和細胞周期采用單因素方差分析；MTT采用

8、析因設計的方差分析；多重比較采用SNK或LSD檢驗；裸鼠皮下移植瘤采用配對樣本t檢驗。 結果： 1、EIF4G1在鼻咽癌中的表達特性鑒定。 1）共收集鼻咽炎組16例、鼻咽癌組40例臨床標本。SP免疫組化結果表明，EIF4G1表達主要定位在細胞膜和細胞漿。EIF4G1在鼻咽癌和非癌鼻咽炎組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義（Z=-3.971，P=0.000），EIF4G1的表達情況與臨床病理分化沒有統(tǒng)計學意義（X2=2.5

9、08，P=0.285）。 2）熒光定量PCR法檢測EIF4G1在永生化鼻咽上皮細胞NP69和鼻咽癌細胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1 mRNA水平表達差異有統(tǒng)計學意義（F=31.575，P=0.000），5-8F表達最高，表達量為NP69 EIF4G1表達量的19.5倍，作為下一步干擾對象。 2、EIF4G1表達沉默對鼻咽癌細胞生物學影響。 1）構建慢病毒

10、干擾載體和陰性對照載體，包裝慢病毒后感染5-8F細胞，殺稻瘟菌素篩選抗性克隆，熒光定量PCR檢測各克隆的EIF4G1表達情況，篩選出干擾效率最高的克?。?9%）為下一步實驗的研究對象，Western blot驗證干擾后蛋白表達效率。陽性克隆的干擾效率與5-8F和陰性對照細胞表達差異有統(tǒng)計學意義（F=11.897，P=0.000），同時檢測EIF4G1在陰性對照中的表達相對于5-8F強度較一致（1.009±0.066）。陽性干擾克隆命名為

11、5-8F/pshRNA-EIF4G1-，陰性對照克隆為5-8F/pshRNA。 2）MTT法檢測細胞增殖情況，與陰性對照5-8F/pshRNA和5-8F細胞相比，干擾克隆細胞5-8F/pshRNA-EIF4G1-的增殖速度明顯減慢并且呈時間依賴關系，有統(tǒng)計學差異（F=131.448，P=0.000）；western-blot結果顯示5-8F/pshRNA-EIF4G1-細胞EIF4G1表達下調80.1%；流式細胞術結果也表明各組

12、細胞中S期和G2/M期變化具有統(tǒng)計學差異（F=22.426，P=0.002和F=7.354，P=0.024），EIF4G1干擾后影響細胞的細胞周期正常移行，阻止S期細胞進入G2/M期，造成5-8F/pshRNA-EIF4G1-S期細胞聚集，G2/M期細胞減少；平板克隆形成實驗顯示三組細胞的克隆形成率差異有統(tǒng)計學意義（F=54.615，P=0.000），5-8F/pshRNA-EIF4G1-細胞克隆形成減少，5-8F和陰性對照組差異無統(tǒng)計

13、學意義（P=0.732）。綜合表明EIF4G1表達干擾后，5-8F細胞體外生長被顯著抑制。 3）Transwell小室檢測結果顯示，與5-8F和5-8F/pshRNA細胞相比，5-8F/pshRNA-EIF4G1-細胞穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)減少，差異具有顯著性（F=38.329，P=0.000）；Boyden小室檢測結果顯示三組細胞的的侵襲能力具有顯著性差異（F=6.170，P=0.014），5-8F/pshRNA-EIF4G1

14、-細胞的侵襲能力顯著降低，說明EIF4G1表達沉默降低了5-8F細胞的體外遷移和侵襲能力。 4）將5-8F/pshRNA-EIF4G1-和5-8F/pshRNA細胞分別對稱接種于裸鼠上肢腋窩和下肢腹股溝，21天后解剖取瘤塊并稱重，上、下肢成瘤的5-8F/pshRNA和5-8F/pshRNA-EIF4G1-細胞移植瘤重量差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.032，P=0.041），表明干擾EIF4G1對裸鼠移植瘤生長產生影響；移植瘤免疫組

15、化結果表明，EIF4G1在干擾組中的表達明顯下調，提示干擾克隆在體內成瘤后EIF4G1仍維持于低表達的狀態(tài)。 結論： 1、免疫組化SP法證實EIF4G1的表達與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關系。 2、熒光定量PCR法檢測EIF4G1在永生化鼻咽上皮細胞NP69和鼻咽癌細胞5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1中的表達有差異，5-8F表達最高。 3、利用慢病毒載體和R