糖皮質(zhì)激素保護腎小球足細胞損傷及促進其損傷后修復(fù)機制.pdf

1、研究背景:足細胞是局灶節(jié)段腎小球硬化(FSGS)腎組織病變形成的主要受損靶細胞。研究表明，足細胞受到損傷后，發(fā)生凋亡、自噬、壞死，導(dǎo)致其數(shù)目減少。腎小球內(nèi)足細胞數(shù)目減少直接導(dǎo)致了蛋白尿的發(fā)生和腎小球硬化形成，最終影響腎功能。近年來，隨著腎小球壁層上皮progenitor細胞的發(fā)現(xiàn)，在腎小球足細胞損傷修復(fù)研究領(lǐng)域，足細胞再生修復(fù)機制引起人們重視。足細胞損傷后，是否發(fā)生壁層上皮細胞向足細胞轉(zhuǎn)分化，增生修復(fù)脫落的足細胞，防止腎小球硬化發(fā)生，是

2、腎小球再生修復(fù)研究的重點。
　　 糖皮質(zhì)激素類藥物被廣泛用于治療由足細胞病變導(dǎo)致的腎病綜合征，例如FSGS。然而，該領(lǐng)域尚缺乏糖皮質(zhì)激素類藥物是否可直接作用于腎小球固有細胞，促進足細胞損傷再生修復(fù)的機制研究。
　　 因此，本課題的總研究目的將探討糖皮質(zhì)激素對足細胞的直接保護作用，以及是否具有促進其再生修復(fù)作用。研究將證實，該作用是否與壁層上皮progenitor細胞向足細胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。
　　 本研究由兩部分組成:

3、
　　 第一部分:體內(nèi)動物試驗觀察糖皮質(zhì)激素治療FSGS模型小鼠對其足細胞保護和損傷后修復(fù)的作用。
　　 目的:通過體內(nèi)動物試驗證實，糖皮質(zhì)激素是否具有足細胞保護作用，以及糖皮質(zhì)激素是否能促進腎小球足細胞再生，而該過程與增加腎小球壁層上皮progenitor細胞有關(guān)。
　　 方法:
　　 1.通過具有足細胞毒性的抗腎小球足細胞抗體誘導(dǎo)B6129SV/j小鼠建立臨床表現(xiàn)為蛋白尿，腎臟病理表現(xiàn)為局灶節(jié)段性腎小

4、球硬化的小鼠動物模型。
　　 2.在模型建立后第3天，經(jīng)皮下注射糖皮質(zhì)激素，分別與治療2周、4周后行活檢，獲取腎組織。
　　 3.重點通過免疫組織化學(xué)染色方法，觀察腎小球病理形態(tài)學(xué)變化，足細胞數(shù)目增減情況，以及腎臟固有細胞凋亡和腎小球壁層上皮細胞分化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.連續(xù)兩天抗體注射誘導(dǎo)后，腎小球足細胞與模型第3天已出現(xiàn)明顯下降，糖皮質(zhì)激素治療2周和4周后，足細胞數(shù)目得到部分恢復(fù)，腎小球硬化

5、程度減輕，而對照組無此現(xiàn)象。
　　 2.糖皮質(zhì)激素治療腎小球足細胞caspase-3表達明顯下降，首次于體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素具有抗足細胞凋亡作用。
　　 3.糖皮質(zhì)激素治療組腎臟足細胞的progenitor細胞，定義為同時表達足細胞和壁層上皮細胞特有蛋白，其數(shù)目明顯多于對照組;并同時觀察到糖皮質(zhì)激素治療組壁層上皮細胞出現(xiàn)ERK信號通路磷酸化活躍。
　　 4.糖皮質(zhì)激素治療組模型動物，腎小球內(nèi)壁層上皮細胞表達CD

6、44明顯降低，而此現(xiàn)象與腎小球硬化程度成正相關(guān)，提示糖皮質(zhì)激素可能通過抑制CD44表達，而抑制壁層上皮細胞活化，從而減輕上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，參與硬化病變的形成。
　　 結(jié)論:以足細胞損傷為特征的FSGS模型小鼠動物試驗證實，糖皮質(zhì)激素能夠緩解足細胞損傷，促進其再生修復(fù)。此過程可能與糖皮質(zhì)激素抗足細胞凋亡，通過促進腎小球壁層上皮細胞ERK信號通路活化，向足細胞轉(zhuǎn)分化，參與其再生修復(fù)過程有關(guān)。
　　 第二部分:體外細

7、胞培養(yǎng)試驗觀察糖皮質(zhì)激素促進腎小球壁層上皮細胞表達足細胞蛋白檢測。
　　 目的:通過體外細胞培養(yǎng)試驗，觀察糖皮質(zhì)激素是否可誘導(dǎo)腎小球壁層上皮細胞表達足細胞特有蛋白。
　　 方法:
　　 1.通過細胞培養(yǎng)試驗，建立小鼠腎臟壁層上皮細胞系。
　　 2.37℃培養(yǎng)箱中，2％FBS細胞培養(yǎng)液培育細胞14天后，加入不同濃度的(1-20μM)地塞米松，繼續(xù)培育24-72小時。
　　 3.收獲細胞后，行免疫細胞

8、化學(xué)染色，觀察成熟壁層上皮細胞蛋白PAX2和成熟足細胞蛋白synaptopodin表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度和不同培育時間的含地塞米松細胞培養(yǎng)液均能促使壁層上皮細胞表達足細胞特有蛋白synaptopodin，而對照組無此現(xiàn)象。
　　 2.低濃度地塞米松(5μM)促使synaptopodin表達作用明顯，且該現(xiàn)象可發(fā)生于24小時內(nèi)。
　　 結(jié)論:
　　 體外細胞培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激