神經(jīng)母細胞瘤細胞鑒定與微小殘留病檢測研究.pdf

1、目的: 闡明神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma,NB)骨髓微量腫瘤病灶（minimal residual disease, MRD）檢測方法及結果對預后的影響；建立NB骨髓轉移細胞的體外培養(yǎng)與鑒定實驗方法。 方法: 1、應用CD45-FITC/CD81-PE/CD56-PECy5單抗組合通過流式細胞術(flow cytometry, FCM)檢測了人NB細胞株TGW的免疫表型并確定本實驗室FCM的敏感度為1

2、×10-4；比較Ⅲ～Ⅳ期NB患兒治療前及治療中骨髓細胞形態(tài)學檢查與FCM檢測BM中的CD45-/ CD81+/ CD56+細胞陽性率；通過對NB患兒治療前及治療不同階段的BM MRD檢測分析其應用價值。 2、應用熒光定量多聚酶鏈反應法（fluorescent quantitation-polymerase chain reaction,FQ-PCR）檢測骨髓微量神經(jīng)母細胞瘤細胞的酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxyla

3、se, TH)表達，建立了以TH為靶基因FQ-PCR方法檢測微量神經(jīng)母細胞瘤細胞的方法。共檢測臨床NB標本26例，其中包括24例骨髓標本，1例胸水標本和1例干細胞采集物，陰性對照為5例正常兒童和11例非神經(jīng)母細胞瘤患兒骨髓。 3、我院血液科門診及病房伴骨髓轉移的NB患兒共17例,經(jīng)骨髓穿刺發(fā)現(xiàn)NB細胞及病理確診，患兒骨髓中瘤細胞鏡檢比例50-80％。無菌條件下取NB骨髓轉移患者骨髓，用Ficoll分離單個核細胞，加入含有雙抗（青

4、霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml）的20％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，接種于6孔培養(yǎng)板中5％C02, 37℃培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)學特點，同時分別應用FCM檢測CD45-/ CD81+/ CD56+的表達、FQ-PCR方法檢測TH的表達及免疫組化方法對原代培養(yǎng)的NB骨髓轉移細胞進行鑒定。 結果: 1、比較了35例初診時FCM檢測BM MRD陽性患兒平均化療4個療程后MRD結果與預后

5、關系，化療4個療程后15例患兒MRD轉陰，其中5例復發(fā)，其余10例隨訪至今無復發(fā)及進展，無瘤生存平均時間23.77個月；另外20例患兒化療4個療程后MRD仍為陽性，其中10例患兒復發(fā)或進展，包括1例死亡，兩組差異有統(tǒng)計學意義。比較了化療后移植患兒外周血干細胞（peripheral blood stem cell, PBSC）采集前骨髓MRD結果與預后的相關性：共有24例患兒接受化療后行外周血干細胞移植，18例患兒采集PBSC時骨髓MRD

6、為陰性，其中5例患兒復發(fā)，自移植后始DFS平均時間32.45個月；6例患兒采集PBSC時骨髓MRD為陽性，5例復發(fā)，兩組差異有統(tǒng)計學意義。 2、通過倍比稀釋NB細胞于正常骨髓單個核細胞中，本文確定了FQ-PCR法的敏感性為1×10-5，即可檢測到105個正常骨髓細胞中的一個腫瘤細胞。26例NB標本中陽性24例，陰性2例。陽性對照TGW細胞株表達TH；陰性對照組非腫瘤患兒和其他實體瘤患兒骨髓標本均不表達TH。相同的標本同時行骨髓細

7、胞學檢查及FCM檢測，F(xiàn)Q-PCR陽性率為92.3％，F(xiàn)Q-PCR結果陽性者細胞學檢查和FCM（76.9％）結果均為陽性。 3、我們對17例骨髓轉移的NB患者進行NB骨髓轉移細胞體外原代培養(yǎng),傳代超過15代有5例，其中2例超過20代，經(jīng)FCM、FQ-PCR方法、免疫組化鑒定為NB細胞，最終細胞因反復傳代失去強增殖能力。 結論: 1、運用FCM檢測NB患兒BM中的MRD敏感度高、特異性強，可協(xié)助初診NB患兒的診斷、