泛素連接酶Ring2在苯并[a]芘致人支氣管上皮細胞DNA損傷及組蛋白單泛素化中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 通過運用RNA干擾技術下調(diào)泛素連接酶Ring2基因的表達水平，探討Ring2在苯并[a]芘致人支氣管上皮細胞DNA損傷及組蛋白H2A單泛素化中的作用。
　　 方法：
　　 取對數(shù)生長期16HBE細胞，在RNA干擾泛素連接酶Ring2基因前后，分別進行不同濃度B[a]P（0，1,2,4，8，16,32μmol/L）染毒24h;同一濃度(2，8，16μmol/L)B[a]P染毒不同時間(0，1,2,4，

2、8，12，24h)以及同一濃度(2，8，16μmol/L)B[a]P染毒2h后恢復不同時間(0，1,2,4，8，12，24h)實驗，用單細胞凝膠電泳實驗檢測細胞DNA損傷水平，并以Olive尾距值(Olive Tail Moments，OTM)評價DNA損傷程度；用WESTERN-BLOT法檢測組蛋白H2A單泛素化水平。
　　 結果：
　　 Ⅰ、RNA干擾前
　　 1、單細胞凝膠電泳結果顯示：不同濃度B[a]P染

3、毒24h時，隨著染毒劑量的升高，各組細胞DNA損傷程度增強，且與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；同一濃度(2，8，16μmol/L)B[a]P染毒不同時間時，隨著染毒時間的延長，各組細胞DNA損傷程度增強，且與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);2μmol/LB[a]P染毒2h后恢復不同時間時，隨著恢復時間的延長，OTM逐漸下降，且在恢復2h后，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);8μmol/LB[a]P染毒2h后恢復不同時間

4、時，與對照組相比，恢復1h時OTM值略升高，但無顯著性差異，恢復2h時OTM值開始下降，但無顯著性差異，隨著恢復時間的延長，各組細胞OTM值下降明顯，差異有顯著性（P＜0.01）；16μmol/LB[a]P染毒2h后恢復不同時間時，與對照組相比，恢復th時OTM值有顯著性升高(P＜0.01)，隨著恢復時間的延長，各組細胞的OTM值顯著性下降(P＜0.01)。
　　 2、WESTERN-BLOT結果顯示：不同濃度B[a]P染毒24

5、h時，隨著染毒濃度的增高，組蛋白H2A單泛素化表水平增高，且與正常細胞組相比，各染毒組都有顯著性差異（P＜0.01）；2μmol/LB[a]P染毒不同時間時，隨著染毒時間的延長，組蛋白H2A單泛素化水平增高明顯，與對照組相比，染毒2h后差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；8μmol/LB[a]P染毒不同時間時，隨著染毒時間的延長，組蛋白H2A單泛素化水平增高明顯，與對照組相比，各染毒組差異都有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；16μmol/LB

6、[a]P染毒不同時間時，隨著染毒時間的延長，組蛋白H2A單泛素化水平增高明顯，與對照組相比，染毒4h后差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；2μmol/LB[a]P染毒2h后恢復不同時間時，與對照組相比，各染毒恢復組細胞組蛋白H2A泛素化水平增高，差異有顯著性（P＜0.01），且在8h處達到最大值；8μmol/LB[a]P染毒2h后恢復不同時間時，與對照組相比，各染毒恢復組細胞組蛋白H2A泛素化水平增高，差異有顯著性(P＜0.01)，且在8

7、h處達到最大值；16μmol/LB[a]P染毒2h后恢復不同時間時，與對照組（恢復0h）相比，恢復th時H2A泛素化水平略有增高，差異無顯著性，恢復2h時增高明顯(P＜0.05)，其余各染毒恢復組H2A泛素化水平增高明顯，差異有顯著性(P＜0.01)，且在8h處達到最大值。
　　 3、回歸分析不同濃度的B[a]P染毒細胞24h組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關關系,且相關的回歸方程符合Cubic模型：Y=5.25

8、1-278.807X2+736.392X3(R2=0.910P＜0.01);2μMB[a]P染毒不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關關系，且相關的回歸方程符合Cubic模型：Y=2.306-38.713X+209.283X2-234.211X3(R2=0.723P＜0.05);8μMB[a]P染毒不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關關系，且相關的回歸方程符合Exponential模型：Y=Ex

9、p(0.085+11.476X)(R2=0.77P＜0.01);16μMB[a]P染毒不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關關系，且相關的回歸方程符合Cubic模型：Y=13.269-169.591X+669.054X2-625.192X3(R2=0.944P＜0.01);2μMB[a]P染毒2h后恢復不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關關系，且相關的回歸方程符合Linear模型：Y=1.574

10、-2.753X3(R2=0.603P＜0.05);8μMB[a]P染毒2h后恢復不同時間組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關關系，且相關的回歸方程符合Cubic模型：Y=7.353-21.907X+41.582X3(R2=0.503P＜0.05);16μMB[a]P染毒2h后恢復不同時間致組的H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)有相關關系，且相關的回歸方程符合Cubic模型：Y=6.852_23.601X+58.494

11、X3(R2=0.750P＜0.05).
　　 Ⅱ、RNA干擾序列刷選
　　 轉染效率及基因沉默效率結果：16HBE以50nmol/LsiRNA轉染6h后，分別培養(yǎng)24h和30h組，與序列對照組相比，各Ring2干擾組Ring2表達水平降低明顯，且差異都有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，在培養(yǎng)30h時，對Ring2基因的抑制率最高且達到72％。
　　 Ⅲ、RNA干擾后
　　 1、單細胞凝膠電泳結果顯示：不同濃度

12、B[a]P染毒24h時，隨著染毒劑量的升高，各組細胞DNA損傷程度增強，且與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；同一濃度(2，8，16μmol/L)B[a]P染毒不同時間時，隨著染毒時間的延長，各組細胞DNA損傷程度增強，且與對照組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；2μmol/LB[a]P染毒2h后恢復不同時間時，隨著恢復時間的延長，OTM逐漸下降，且在恢復2h后，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);8μmol/LB[a]P染毒2h后

13、恢復不同時間時，與對照組相比，隨著恢復時間的延長，各組細胞OTM值下降明顯，差異有顯著性(P＜0.01);16μmnol/LB[a]P染毒2h后恢復不同時間時，與對照組相比，恢復2h后各組細胞的OTM值顯著性下降(P＜0.01)。
　　 2、WESTERN-BLOT結果顯示：不同濃度B[a]P染毒24h時，隨著染毒濃度的增高，組蛋白H2A單泛素化表水平變化不明顯，且與正常細胞組相比，各染毒組都無顯著性差異；同一濃度（2、8、16

14、μmol/L）B[a]P染毒不同時間時，隨著染毒時間的延長，組蛋白H2A單泛素化水平變化不明顯，與對照組相比，各染毒組差異無統(tǒng)計學意義；同一濃度(2、8、16μmol/L)B[a]P染毒2h后恢復不同時間時，與對照組相比，各染毒恢復組細胞組蛋白H2A泛素化水平變化不明顯，各染毒組差異無顯著性。
　　 3、回歸分析顯示，各組H2A單泛素化水平(X)與OTM值(Y)無相關關系。
　　 Ⅳ、協(xié)方差分析顯示，在泛素連接酶Ring