端粒結(jié)合蛋白在煤焦瀝青煙提取物致人支氣管上皮細(xì)胞惡變中的作用.pdf

1、背景：研究已發(fā)現(xiàn)絕大部分腫瘤細(xì)胞的端?？s短,端粒酶活性增強(qiáng),保持端粒的穩(wěn)定是防止細(xì)胞癌變的一個(gè)重要步驟。端粒是真核細(xì)胞染色體末端非編碼DNA重復(fù)序列和與之相連的端粒結(jié)合蛋白的功能性復(fù)合體,端粒過(guò)度消耗或者結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致其功能障礙可引起細(xì)胞發(fā)生癌變。端粒結(jié)合蛋白包括端粒酶、保衛(wèi)蛋白復(fù)合體(Shelterin)及非保衛(wèi)蛋白。端粒酶主要包括端粒RNA成分、端粒酶相關(guān)蛋白(TP1/TP2)和端粒酶催化亞單位(hTERT)。
　　 目前為止

2、,端粒結(jié)合蛋白的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)情況及其相互關(guān)系仍不十分清楚,其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的變化以及引起端粒損傷最終導(dǎo)致癌癥的機(jī)制仍不清楚。該課題組已發(fā)現(xiàn)中溫煤焦瀝青煙可致BEAS-2B細(xì)胞端粒縮短、端粒酶活力增高、端粒保衛(wèi)蛋白1(POT1)與端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1(TRF1)的mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)、端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2(TRF2)的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)。該研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)分別抑制POT1和hTERT基因表達(dá)來(lái)觀察煤焦瀝青染毒B

3、EAS-2B細(xì)胞端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2、POT1和hTERT等mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)等,分析他們?cè)诩?xì)胞惡變中的作用。
　　 目的：探討端粒結(jié)合蛋白的mRNA表達(dá)以及蛋白表達(dá)在煤焦瀝青致端粒損傷和細(xì)胞惡變中的作用。
　　 方法：根據(jù)POT1和hTERT的mRNA序列分別設(shè)計(jì)和合成各6組shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體。BASE-2B細(xì)胞以煤焦瀝青組,DMSO溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組分別進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)至1代、10代、20代和30

4、代時(shí)分別使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)至第1d、4d、7d時(shí)分別進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。采用Realtime PCR檢測(cè)端?？s短情況;Realtime PCR檢測(cè)POT1,TRF1,FRF2和hTERT的mRNA表達(dá)情況;Western Blot方法檢測(cè)各蛋白及端粒酶表達(dá)情況;探討各指標(biāo)之間及其與細(xì)胞惡變發(fā)生的關(guān)系。
　　 結(jié)果：將針對(duì)POT1基因設(shè)計(jì)及合成成功的shRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染入BASE-2B細(xì)胞后成功抑制P

5、OT1基因的表達(dá);將針對(duì)hTERT基因設(shè)計(jì)及合成成功的shRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染入BASE-2B細(xì)胞后成功抑制hTERT基因的表達(dá)。抑制POT1基因的表達(dá)后,煤焦瀝青作用24h后觀察發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞死亡,抑制組與陰性對(duì)照組相比較,抑制POT1基因的表達(dá)可導(dǎo)致hTERT的mRAN表達(dá)水平下調(diào),端粒DNA相對(duì)長(zhǎng)度縮短,TRF1與TRF2的mRNA表達(dá)水平上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。抑制hTERT基因的表達(dá)后,煤焦瀝青作用24 h后觀

6、察發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞死亡,直至第7d不再出現(xiàn)細(xì)胞死亡,存活細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng),抑制組與陰性對(duì)照組相比較,抑制hTERT基因的表達(dá)可導(dǎo)致POT1、TRF2的mRNA表達(dá)水平均下調(diào),端粒DNA相對(duì)長(zhǎng)度縮短,TRF1的mRNA表達(dá)水平上調(diào),且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組蛋白的表達(dá)水平和各基因的mRNA表達(dá)水平相一致。通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)20代、30代POT1抑制組細(xì)胞克隆數(shù)及克隆率大于陰性對(duì)