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文檔簡介
1、研究背景: 石棉因具有保溫、絕緣、耐高溫等性能而廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。由于石棉已是國際公認(rèn)的職業(yè)病危害因素,可誘發(fā)石棉肺和惡性腫瘤(如支氣管肺癌、間皮瘤等)石棉相關(guān)疾病,發(fā)達國家已經(jīng)嚴(yán)格限制石棉的使用,而大力提倡使用石棉替代品。耐火陶瓷纖維(Refractory Ceramic Fibers,RCF)與石棉具有相似的理化特性,是目前應(yīng)用較為廣泛的石棉替代品,但其對人體的危害性及其危害機理是衛(wèi)生學(xué)研究的重要課題。一些體外實驗可以提供
2、耐火陶瓷纖維等石棉替代品對人體的生物危害效應(yīng)及其分子作用機理等有價值的信息,其中用耐火陶瓷纖維刺激肺間皮細胞和肺上皮細胞的體外試驗研究已有較多的文獻報道,但人造礦物纖維對呼吸道上皮細胞,特別是支氣管上皮細胞的實驗研究報道較少。本項研究通過細胞毒性試驗、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)等實驗方法和手段,研究耐火陶瓷纖維致體外人支氣管上皮細胞(Human Bronchial Epithelial Cells,BEAS-2B)細胞凋亡和DNA損傷的作用
3、,為探尋耐火陶瓷纖維誘發(fā)人體支氣管肺癌的病變機理提供依據(jù),為臨床診治提供參考。 研究目的: 研究不同理化組成和不同濃度的耐火陶瓷纖維及其浸出液對體外培養(yǎng)的BEAS-2B的形態(tài)變化、凋亡、DNA損傷的作用,以及相關(guān)凋亡基因caspases-3、PARP的表達水平,測試耐火陶瓷纖維及其浸出液誘導(dǎo)BEAS-2B產(chǎn)生ROS的效應(yīng),以及CAT、DMSO和甘露的抗氧化作用,初步明確RCF對人支氣管上皮細胞的細胞毒性和氧化機理。
4、 研究方法: 細胞培養(yǎng):BEAS-2B細胞以RPMI1640培養(yǎng)液加10%胎牛血清、青霉素100U/ml、慶大霉素10mg/L、兩性霉素-B2mg/L、谷氨酰胺2mM和非必需氨基酸,在37℃、5慶大霉素10mg/L、兩性霉素-B2mg/L、谷氨酰胺2mM和非必需氨基酸,在37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每周傳代1次,傳代后第3天更換新鮮培養(yǎng)液。 細胞毒性試驗:倒置顯微鏡下觀察BEAS-2B細胞對臺盼藍(
5、TrypanBlue)的吞噬,以鑒定細胞的成活率;檢測細胞培養(yǎng)液中LDH的量,以評價耐火陶瓷纖維對細胞的毒性:噻唑藍(MTT)法測定耐火陶瓷纖維對細胞活力的影響。 細胞形態(tài)觀察:HE染色觀察細胞形態(tài)變化,掃描電鏡觀察細胞吞噬纖維行為。 單細胞凝膠電泳:檢測耐火陶瓷纖維及其浸出液對細胞DNA的損傷程度及細胞自身DNA修復(fù)能力。 DNALADDER試驗:用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA技術(shù)檢測耐火陶瓷纖維及其浸出液致BEA
6、S-2B細胞凋亡作用。 YO-PRO-1和PI聯(lián)合染色定量檢測細胞凋亡:用YO-PRO-1和PI聯(lián)合染色定量檢測耐火陶瓷纖維及其浸出液致細胞發(fā)生凋亡的比例。 RT-PCR檢測mRNA水平:用耐火陶瓷纖維懸液及浸出液刺激BEAS-2B細胞后,提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,RT-PCR法檢測細胞中caspases-3、caspases9和PARP1的表達水平。 細胞內(nèi)ROS的測定:以耐火陶瓷纖維刺激BEAS-2B細
7、胞,用熒光探針2',7'-二氯熒光素二脂(DCFH-DA)和雙氫羅丹明123(DHR123)測定細胞內(nèi)ROS水平,并用CAT、DMSO和甘露醇觀察它們對ROS產(chǎn)生的抑制作用。 結(jié)果: BEAS-2B細胞成活率及青石棉毒性:細胞吞噬臺盼藍(TrypanBlue)實驗顯示,20μg/cm2濃度的耐火陶瓷纖維作刺激細胞24h后,95%的細胞拒染;400μg/ml耐火陶瓷纖維浸出液刺激細胞24h后,大于93%的細胞拒染;MTT實
8、驗表明,100μg/cm2以上濃度的耐火陶瓷纖維刺激BEAS-2B細胞24h后,細胞活力明顯下降。 細胞形態(tài):HE染色可見凋亡細胞,纖維粘附在細胞上;電鏡下可見20μg/cm2耐火陶瓷纖維刺激24h后,細胞微絨毛消失,表面光滑,細胞有吞噬纖維行為。 BEAS-2B細胞的DNA損傷及DNA修復(fù):經(jīng)三種20μg/cm2耐火陶瓷纖維懸液及400μg/ml浸出液刺激后,細胞產(chǎn)生DNA拖尾現(xiàn)象,與陰性對照組比較均有顯著性差異(P<
9、0.05,n=3),有時間-效應(yīng)關(guān)系。移去刺激物后,細胞的DNA損傷得到不同程度的修復(fù)??寡趸瘎┛梢詼p少DNA損傷。 細胞凋亡:20μg/cm2耐火陶瓷纖維懸液及400μg/ml浸出液刺激48h后,細胞產(chǎn)72h后小于22%。 Caspases-3、PARP1和caspases9的mRNA水平:20μg/cm2耐火陶瓷纖維懸液及400μg/ml浸出液刺激24h及48h后細胞中caspases-3、caspases9的mRN
10、A水平高于空白組,PARP1的mRNA水平低于對照組。 細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量:熒光探針DHR123與DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS水平,用CAT、DMSO和甘露醇預(yù)處理BEAS-2B細胞后,耐火陶瓷纖維及懸液刺激細胞產(chǎn)生的ROS量減少。所以,耐火陶瓷纖維誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS以H2O2和-OH為主。 結(jié)論: 1.耐火陶瓷纖維及浸出液致BEAS-2B細胞DNA損傷,且有時間-效應(yīng)關(guān)系。 2.去除耐火陶瓷纖維及浸出
11、液刺激后,DNA損傷得以修復(fù),抗氧化劑可減少DNA損傷。 3.耐火陶瓷纖維及浸出液致BEAS-2B細胞凋亡,凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-9的mRNA水平隨刺激時間增加而增加,PARP1的mRNA水平隨刺激時間而輕度下降,抗氧化劑可以抑制caspase-3,caspase-9的表達,增加PARP1的表達。 4.耐火陶瓷纖維懸液及浸出液誘導(dǎo)BEAS-2B細胞產(chǎn)生ROS,產(chǎn)生的ROS以羥自由基(-OH)和過
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