苯并[a]芘暴露的小鼠原代支氣管上皮細(xì)胞中miR-320和miR-494對(duì)細(xì)胞周期的影響.pdf

1、miRNA是一類內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA。成熟的miRNA大小在19～23個(gè)寡核苷酸（nt）左右，其與靶基因mRNA3’UTR上靶序列堿基配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白質(zhì)翻譯或降解mRNA，是發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控現(xiàn)象在真核生物中廣泛存在，不同的組織器官、不同類型的腫瘤、腫瘤的不同發(fā)展階段都存在不同的miRNA的表達(dá)，使miRNA表達(dá)譜具有組織細(xì)胞特異性。苯并[a]芘（B[a]P）是常見的環(huán)境污染物，在生產(chǎn)和生活中

2、有許多的暴露機(jī)會(huì)，也是吸煙相關(guān)肺癌的發(fā)展中起關(guān)鍵作用的成因之一。腫瘤是一類細(xì)胞周期性疾病，致癌作用被看作是細(xì)胞周期內(nèi)在機(jī)制紊亂的結(jié)果。細(xì)胞周期存在多個(gè)檢查點(diǎn)（checkpoint）調(diào)節(jié)各期間的轉(zhuǎn)換及細(xì)胞周期進(jìn)程。在課題組前期工作中，已發(fā)現(xiàn)miR-320和miR-494在anti-BPDE轉(zhuǎn)化的人類支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)最高。本實(shí)驗(yàn)選擇miR-320和miR-494，以B[a]P染毒小鼠原代支氣管上皮細(xì)胞，首次探索了miR-320和miR-

3、494在B[a]P染毒細(xì)胞的細(xì)胞周期中的作用。 方法: 1.小鼠原代支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)在無菌條件下處死小鼠，取出支氣管，立即置于預(yù)冷的Collection培養(yǎng)基中；移入PBS液中去除周圍結(jié)締組織及血管并縱向切開。用Dissociation培養(yǎng)基4℃消化24h加入Culture培養(yǎng)基輕柔地上下倒置管子12次，重復(fù)操作一次。離心，用Culture培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液接種于60mm的培養(yǎng)皿中，2h后收集未貼壁細(xì)胞。將

4、細(xì)胞接種于已用胎盤膠原包被的24孔板內(nèi)，用Culture培養(yǎng)基在正常培養(yǎng)條件下，37℃、5％CO2下培養(yǎng)24h。次日棄去Culture培養(yǎng)基，添加Differentiation培養(yǎng)基，37℃、5％CO2下培養(yǎng)。 2.原代細(xì)胞的染毒B[a]P粉末溶于DMSO中，細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO的終濃度不超過0.1％。用經(jīng)多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿微粒體酶系（S9）并加相應(yīng)的輔助因子（6-磷酸葡萄糖、輔酶Ⅱ）配制成體外代謝活化系統(tǒng)。S9混合液隨配

5、隨用。原代細(xì)胞在無血清培養(yǎng)的第二天，分別用0.01μM，0.10μM和1.00μM并加S9活化的B[a]P無血清培養(yǎng)基染毒細(xì)胞，分別作用12h、24h、48h后棄去染毒液，PBS洗滌，繼續(xù)在正常培養(yǎng)條件下無血清培養(yǎng)。 3.原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟按照Hiperfect轉(zhuǎn)染試劑24孔板轉(zhuǎn)染操作指南進(jìn)行。miR-320和miR-494抑制物（anti-miR-320，anti-miR-494）在反應(yīng)體系的終濃度為30nmol/L，

6、轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24h后可棄去培養(yǎng)基。用熒光素FAM標(biāo)記的陰性對(duì)照檢測(cè)抑制物的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％～95％。 4.QRT-PCR檢測(cè)miR-320和miR-494的表達(dá)用Trizol抽提各組樣本的總RNA。按下列成分分別組成20IA miR-320、miR-494及18s RNA的定量PCR反應(yīng)體系：10μl2×Real-time PCR Master Mix，0.16μl miRNA specific primer set（20μM），

7、2μlcDNA template，and0.2μl Taq DNA聚合酶（5U/μl），加d3H2O至20μl。執(zhí)行如下程序：95℃3min，95℃30s，62℃40s，循環(huán)40次。以18sRNA作為內(nèi)參照，采用△△Ct法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析。 5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布將細(xì)胞懸液離心，加入緩沖液重懸細(xì)胞，參照Cycle TEST Plus DNA reagent試劑盒說明書進(jìn)行染色。FACSArray流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DN

8、A含量，并應(yīng)用Modfit LT3.0軟件分析細(xì)胞周期。 6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)CDK6的表達(dá)水平采用間接免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行免疫熒光染色。一抗37℃孵育30min，用緩沖液洗滌2次后加二抗37℃避光孵育30min；緩沖液洗滌、重懸細(xì)胞。用FACSArray流式細(xì)胞儀進(jìn)行CDK6含量的檢測(cè)。以熒光指數(shù)（fluorescence index，F(xiàn)I）表示CDK6的相對(duì)含量。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS

9、15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.miR-320和miR-494在B[a]P暴露的小鼠原代支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)分別以0.01μM、0.10μM和1.00μM的B[a]P并加S9活化染毒細(xì)胞。各劑量組B[a]P分別作用12h，24h及48h后，miR-320和miR-494表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)。其中，1.00μM組的miR-320和miR-494表達(dá)均

10、顯示出明顯的時(shí)間依賴關(guān)系。選取1.00μM B[a]P作用24h的條件進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 2.miR-320和miR-494表達(dá)水平的有效抑制miR-320和miR-494的抑制物能分別特異有效地抑制miR-320和miR-494的表達(dá)。與B[a]P組相比，miR-320的表達(dá)水平在anti-miR-320組降低96.7％，差異顯著；而在anti-miR-494組卻無明顯的變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同樣地，miR-494的表達(dá)水平在

11、anti-miR-494組明顯地下調(diào)98％，差異顯著；而在anti-miR-320組變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.miR-320和miR-494對(duì)染毒細(xì)胞細(xì)胞周期的影響小鼠原代支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)過1.00μM B[a]P作用24h后，出現(xiàn)了G1期阻滯的現(xiàn)象。與溶劑對(duì)照組的62.70％±1.54％的G1期細(xì)胞比例相比，B[a]P組細(xì)胞周期的進(jìn)程被阻滯，84.28％±0.36％的細(xì)胞停留在此間期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在分別轉(zhuǎn)染了

12、miR-320和miR-494的抑制物的anti-miR-320組和anti-miR-494組中，G1期細(xì)胞比例分別降低至60.57％±3.41％和57.52％±2.43％，與B[a]P組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在anti-miR-nc組里，G1期細(xì)胞比例無明顯的改變。 4.miR-320和miR-494對(duì)染毒細(xì)胞CDK6表達(dá)水平的調(diào)控細(xì)胞經(jīng)過1.00μMB[a]P染毒處理24h后，與溶劑對(duì)照組相比，CDK6的表達(dá)值由0.86

13、±0.06降低至0.41±0.03，下降幅度達(dá)52.3％，差異顯著。而在分別轉(zhuǎn)染了miR-320和miR-494的抑制物作用24h后，anti-miR-320組和anti-miR-494組均出現(xiàn)CDK6表達(dá)水平的恢復(fù)，與B[a]P組相比，CDK6的表達(dá)量分別有2.0±0.3與2.1±0.6倍的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1.用冷消化和無血清培養(yǎng)的方法成功培養(yǎng)了小鼠原代支氣管上皮細(xì)胞。 2.miR-320和