負(fù)載全腫瘤抗原及SOCS1siRNA轉(zhuǎn)染的樹(shù)突狀細(xì)胞殺傷兒童惡性腫瘤細(xì)胞的研究.pdf

1、研究背景：
　　兒童惡性腫瘤現(xiàn)已成為危害兒童生命的常見(jiàn)疾病。與成人惡性腫瘤一樣，目前對(duì)兒童惡性腫瘤的治療多采用手術(shù)、化療、放療三大傳統(tǒng)治療。由于兒童的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)不同于成人，常用的放化療措施均伴隨著明確的近、遠(yuǎn)期毒副作用，影響患者的生長(zhǎng)發(fā)育及長(zhǎng)期生存者的生活質(zhì)量，且伴有轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率高的風(fēng)險(xiǎn)。因此，亟需一種高效、安全的治療兒童惡性腫瘤的方法。
　　基于樹(shù)突狀細(xì)胞（dendriticcells，DCs）的免疫治療正逐

2、漸成為治療腫瘤患者的重要方法之一。正常情況下，DC以不成熟的形式存在。未成熟的DC激活T淋巴細(xì)胞的能力較弱，只有成熟的DC能刺激初始T淋巴細(xì)胞，使T細(xì)胞活化，刺激機(jī)體免疫應(yīng)答。如何大量高效率制備體外誘導(dǎo)的DC，并增強(qiáng)DC誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫能力，已成為研究DC疫苗的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。
　　機(jī)體針對(duì)自身腫瘤相關(guān)抗原的免疫殺傷受到內(nèi)源性抑制機(jī)制的制約，常導(dǎo)致殺傷效力減低，對(duì)許多腫瘤的免疫治療因此難以取得預(yù)期效果。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子信號(hào)傳

3、導(dǎo)抑制蛋白（SOCS1）是存在于DC內(nèi)調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活能力及獲得性免疫的內(nèi)源性抑制分子。SOCS1可抑制T細(xì)胞及其它免疫細(xì)胞內(nèi)的JAK活性，對(duì)多種細(xì)胞因子（如IFN-γ等）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)均起抑制作用，是調(diào)節(jié)DC抗原提呈以及獲得性免疫幅度的關(guān)鍵分子之一。在DC內(nèi)抑制SOCS1的表達(dá)是否可增強(qiáng)DC誘導(dǎo)的特異性殺傷兒童惡性腫瘤細(xì)胞的能力，迄今鮮有報(bào)道。
　　因此，本研究的目的是：
　　1)探索從外周血單核細(xì)胞（PBMC）獲取大量成熟DC

4、的可行性及刺激DC成熟的策略。
　　2)觀察負(fù)載全腫瘤抗原的DC刺激T細(xì)胞對(duì)其增殖及殺傷自體及異體實(shí)體瘤鼻咽瘤細(xì)胞能力的影響。
　　3)探討用siRNA技術(shù)沉默SOCS1表達(dá)，觀察其對(duì)DC抗腫瘤免疫能力的作用，為提高DC臨床免疫治療兒童非實(shí)體瘤白血病的療效提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)：活檢組織采用組織塊法培養(yǎng)。CNE-2Z及K562細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)。
　　2)全腫瘤抗原制

5、備：采用反復(fù)凍融法，并用60Coγ射線照射（劑量25Gy）。
　　3)DC的體外誘導(dǎo)及擴(kuò)增：采用PBMC分離法，加入細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天加入全腫瘤抗原、第7天加入TNF-α刺激DC成熟。
　　4)DC形態(tài)學(xué)鑒定：分別采用倒置顯微鏡、掃描電鏡和投射電鏡。
　　5)DC表面抗原及成熟度檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀法。
　　6)腫瘤DC刺激T細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：采用四氮唑藍(lán)試驗(yàn)（MTT法）。
　　

6、7)腫瘤DC活化的CTL體外殺傷活性檢測(cè)：采用MTT法。
　　8)腫瘤DC活化的CTL分泌IFN-γ能力檢測(cè)：采用ELISPOT實(shí)驗(yàn)。
　　9)DC內(nèi)SOCS1的表達(dá)：分別用RT-PCR和Westernblot測(cè)定其mRNA和蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1)DC形態(tài)學(xué)鑒定：倒置顯微鏡及電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面典型的樹(shù)突樣突起。
　　2)培養(yǎng)5天負(fù)載全腫瘤抗原的DC（未成熟DC），其細(xì)胞表面標(biāo)志性分子HLA-D

7、R、CD1a、CD80、CD83和CD86經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性率分別為：(60.86±5.42)％、(21.84±2.52)％、(5.49±6.32)％、(6.82±1.24)％和(1.24±0.90)％，而經(jīng)過(guò)TNF-α刺激的負(fù)載全腫瘤抗原的DC（成熟DC），上述細(xì)胞表面分子的陽(yáng)性率分別為(86.14±8.32)％、(78.28±11.42)％、(78.24±12.64)％、(67.25±14.24)％和(85.26±9.14)％，各表

8、面分子的表達(dá)明顯高于未成熟DC（P<0.01～0.05）。
　　3)隨著DC:T細(xì)胞比例由1:100增至1:5，各組T細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)均呈增加趨勢(shì)。負(fù)載全腫瘤抗原的DC刺激T細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)高于未負(fù)載全腫瘤抗原的DC。
　　4)經(jīng)過(guò)負(fù)載全腫瘤抗原的DC活化的CTL對(duì)自體或異體鼻咽癌細(xì)胞均具有殺傷活性，其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的殺傷率與效靶比成正比。
　　5)用負(fù)載全腫瘤抗原的DC孵育的T細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)目顯著多于

9、未負(fù)載全腫瘤抗原的DC組和單獨(dú)T細(xì)胞組（P﹤0.05）。
　　6)在培養(yǎng)第7天加入TNF-α（1000U/mL）刺激DC成熟后，K562-DC中SOCS1mRNA和蛋白表達(dá)增加。經(jīng)SOCS1siRNA（SOCS1siRNA1和siRNA2）轉(zhuǎn)染成熟DC24h可明顯降低K562-DC中SOCS1mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　7)培養(yǎng)5天負(fù)載全腫瘤抗原的DC（未成熟DC），其細(xì)胞表面標(biāo)志性分子HLA-DR，CD1a、CD80、CD

10、86和CD83經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性率分別為：(54.65±3.28)％、(17.42±6.78)％、(6.27±5.29)％、(3.02±2.47)％和(3.28±2.79)％，而用TNF-α誘導(dǎo)K562-DC成熟，各表面分子的陽(yáng)性率分別為(69.52±8.68)％、(58.97±4.25)％、(63.84±7.32)％、(72.69±6.23)％和(71.46±4.96)％，均顯著高于未成熟DC（P<0.01～0.05）。經(jīng)SOCS1s

11、iRNA轉(zhuǎn)染成熟DC24h后，上述分子的陽(yáng)性率分別為(67.17±9.53)％、(59.46±5.17)％、(65.72±6.58)％、(71.47±5.68)％和(87.92±3.94)％。其中CD83的陽(yáng)性率顯著高于未轉(zhuǎn)染DC組（P<0.05）。
　　8)TNF-α刺激成熟的K562-DCs其刺激T細(xì)胞增殖的能力明顯高于未成熟DC，且隨著DC:T細(xì)胞比例的增加，刺激能力增強(qiáng)，以效靶比1:5時(shí)刺激作用最為顯著（效靶比1:20及1

12、:5時(shí)均有P<0.01）。SOCS1siRNA轉(zhuǎn)染后K562-DCs刺激T細(xì)胞增殖的能力較之scramblesiRNA后的K562-DCs強(qiáng)，二者比較有顯著性差異（P<0.05）。
　　9)經(jīng)TNF-α刺激成熟的K562-DCs其刺激外周血T細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率明顯增加，在效靶比為5～20:1時(shí)殺傷率增加尤為明顯（成熟DCvs.未成熟DC,P<0.01）。采用SOCS1siRNA轉(zhuǎn)染的K562-DCs刺激外周血T細(xì)胞可使T細(xì)

13、胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率進(jìn)一步增加（P<0.05），其對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率的影響強(qiáng)度與效靶比成正比。
　　10)成熟的K562-DCs刺激后，外周血T細(xì)胞分泌IFN-γ的數(shù)目增加（成熟DCvs.未成熟DC，P<0.01）。而采用SOCS1siRNA轉(zhuǎn)染的K562-DCs刺激外周血T細(xì)胞可進(jìn)一步增加IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)目（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1)從PBMC來(lái)源的、負(fù)載全腫瘤抗原的DC經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)成熟后，

14、可刺激T細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。
　　2)SOCS1siRNA轉(zhuǎn)染可有效抑制DC內(nèi)SOCS1表達(dá)，可突破內(nèi)源性抑制機(jī)制的制約，使成熟DC誘導(dǎo)出更強(qiáng)的反應(yīng)，表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞增殖反應(yīng)增加及其對(duì)K562細(xì)胞的殺傷能力增強(qiáng)。
　　綜上所述，我們的結(jié)果提示，負(fù)載全腫瘤抗原的DC可能是治療兒童惡性腫瘤的一種有效方法，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。而采用SOCS1siRNA抑制SOCS1，增強(qiáng)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，可能是一