腫瘤-睪丸抗原蛋白負(fù)載樹突狀細(xì)胞構(gòu)建肺癌疫苗的研究.pdf

1、肺癌是常見惡性腫瘤之一，盡管近年來手術(shù)、化療、放療三大經(jīng)典治療手段在不斷發(fā)展進步，肺癌總的生存率并未得到明顯提高，80％的肺癌在診斷后1年內(nèi)死亡，5年生存率僅為14％。 隨著腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤生物治療成為一支非?；钴S的生力軍，其中經(jīng)典的免疫治療以其糾正患者免疫缺陷、啟動自身特異性殺瘤反應(yīng)、建立有效的免疫應(yīng)答成為生物治療中最有希望的途徑之一。樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)是體內(nèi)功能最強的專職性抗

2、原提呈細(xì)胞，是免疫反應(yīng)的始動者，在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中具有獨特重要的地位。由腫瘤抗原負(fù)載DCs激活T細(xì)胞從而引發(fā)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)是構(gòu)建DCs疫苗進行腫瘤免疫治療的主要目的。 常用于負(fù)載DCs的抗原物質(zhì)有全腫瘤細(xì)胞抗原、腫瘤組織總RNA、DNA、腫瘤抗原RNA、DNA、腫瘤抗原肽和腫瘤抗原蛋白等，按照抗原物質(zhì)的來源可以將這些抗原歸為兩類：一類是直接從腫瘤組織中獲取的抗原物質(zhì)，另一類是人工合成的抗原物質(zhì)。全腫瘤細(xì)胞抗原和腫瘤組織總RN

3、A、DNA屬于第一類，很多研究證實用這類抗原物質(zhì)負(fù)載DCs可以構(gòu)建療效較好的DCs疫苗。本研究組曾開展“人肺癌組織總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞構(gòu)建肺癌疫苗的研究”，證實以肺癌組織總RNA轉(zhuǎn)染DCs能誘導(dǎo)自身T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，該CTL對肺癌細(xì)胞有特異性殺傷作用。由于這類抗原物質(zhì)直接來源于腫瘤組織，構(gòu)建這類疫苗的重要前提是獲得一定數(shù)量級的腫瘤組織。對于無法獲得腫瘤組織的患者

4、，用第二類抗原物質(zhì)，即人工合成的抗原物質(zhì)，構(gòu)建DCs疫苗是非常好的替代方法。這類抗原物質(zhì)有：體外克隆的腫瘤抗原RNA、DNA、人工合成的腫瘤抗原肽以及腫瘤抗原蛋白，它們的總體MiVnt顯微生物圖像分析系統(tǒng)完成圖像分析。該軟件可以將照片中的靶細(xì)胞自動計數(shù)，并計算靶細(xì)胞總面積、分析區(qū)域總面積以及靶細(xì)胞總面積占分析區(qū)域總面積的百分比。CTL殺傷活性的兩種計算方法為： 細(xì)胞毒性(％)=(陰性對照組靶細(xì)胞數(shù)—試驗組殺傷后靶細(xì)胞數(shù))/陰性對

5、照組靶細(xì)胞數(shù)×100％ 細(xì)胞毒性(％)=(陰性對照組靶細(xì)胞面積占分析區(qū)域總面積百分比—試驗組殺傷后靶細(xì)胞面積占分析區(qū)域總面積百分比)/陰性對照組靶細(xì)胞面積占分析區(qū)域總面積百分比×100％ 通過分析軟件測得參數(shù)與實際培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性和與51Cr釋放法測定CTL殺傷活性的結(jié)果進行比較，驗證該方法的準(zhǔn)確性和可靠性。 結(jié)果 1.蛋白負(fù)載后DCs免疫熒光鑒定熒光顯微鏡下見蛋白負(fù)載的DCs胞漿和胞膜出現(xiàn)熒光，尤以胞

6、膜明顯，未經(jīng)任何蛋白負(fù)載的DCs無熒光。 2.蛋白負(fù)載前后DCs分泌IL-12水平負(fù)載蛋白后DCs分泌IL-12的量(73.00±9.53pg/ml)高于負(fù)載前DCs分泌IL-12的量(54.96±7.73pg/ml)(P=0.011)；負(fù)載前DCs分泌IL-12的量高于PBMC分泌IL-12的量(14.72±5.02pg/ml)(P＜0.0001)。 3.蛋白負(fù)載的DCs刺激淋巴細(xì)胞亞群比例的改變DCs兩次刺激淋巴細(xì)胞

7、后，CD3+/CD8+亞群比例顯著上升，由(31.23±3.44)％升至(49.42±5.48)％(P＜0.0001)，CD3+/CD4+亞群和CD56+亞群比例略下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.144和0.082)。 4.蛋白負(fù)載的DCs刺激淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平變化DCs兩次刺激后的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的平均點數(shù)為163.58±33.21，明顯高于DCs刺激1次的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的平均點數(shù)71.00±27.42；

8、DCs刺激1次的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的平均點數(shù)又明顯高于刺激前的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的平均點數(shù)3.83±2.21，差異均有顯著性意義(P＜0.0001)。 5.CTL殺傷活性測定方法的準(zhǔn)確性驗證結(jié)果軟件測得的靶細(xì)胞數(shù)和靶細(xì)胞總面積占分析區(qū)域總面積百分比與實際培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)之間均具有良好的相關(guān)性(r=0.985和0.988，P＜0.0001)，提示軟件分析得出的這兩個參數(shù)均可以較好地反映培養(yǎng)板孔中的細(xì)胞數(shù)目，以這兩個參數(shù)計算CT

9、L殺傷活性是可靠的。 與51Cr釋放法同時檢測CTL殺傷活性時，兩種檢測方法測得的CTL殺傷活性數(shù)值均隨效靶比的升高而增大，提示兩種方法均較穩(wěn)定；在相同效靶比時，本研究采用的檢測方法測得的CTL殺傷活性高于51Cr釋放法測定的數(shù)值。 6.CTL殺傷活性測定結(jié)果對于自體NY-ESO-1陽性腫瘤細(xì)胞，NY-ESO-1、XAGE-1b蛋白共同負(fù)載的DCs和NY-ESO-1蛋白負(fù)載的DCs誘導(dǎo)的CTL殺傷活性較強，高于XAGE-

10、1b蛋白負(fù)載的DCs誘導(dǎo)的CTL殺傷活性；對于自體XAGE-1b陽性腫瘤細(xì)胞，NY-ESO-1、XAGE-1b蛋白共同負(fù)載的DCs和XAGE-1b蛋白負(fù)載的DCs誘導(dǎo)的CTL殺傷活性較強，高于NY-ESO-1蛋白負(fù)載的DCs誘導(dǎo)的CTL殺傷活性；對于自體NY-ESO-1、XAGE-1b雙陽性腫瘤細(xì)胞，NY-ESO-1、XAGE-1b蛋白共同負(fù)載的DCs誘導(dǎo)的CTL殺傷活性最強，在效靶比為80∶1時可達(51.45±3.5)％，高于NY-

11、ESO-1和XAGE-1b蛋白分別負(fù)載的DCs誘導(dǎo)的CTL殺傷活性；CTL對自體NY-ESO-1、XAGE-1b雙陰性腫瘤細(xì)胞的殺傷活性較低；CTL對自體雙陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷活性高于對異體雙陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷活性；未負(fù)載任何蛋白的DCs誘導(dǎo)的CTL對以上腫瘤細(xì)胞的殺傷活性最差；CTL對自身肺上皮細(xì)胞無殺傷活性。 結(jié)論 1.以NY-ESO-1、XAGE-1b蛋白作為抗原物質(zhì)，采用直接混合培養(yǎng)法，可有效地負(fù)載外周血單核細(xì)胞來

12、源的DCs。蛋白負(fù)載后的成熟DCs分泌IL-12的量顯著升高；刺激自身淋巴細(xì)胞中CD3+/CD8+亞群比例顯著升高；刺激后的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的量顯著升高。 2.NY-ESO-1或XAGE-1b蛋白負(fù)載的成熟DCs能誘導(dǎo)自身T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性CTL，對相應(yīng)抗原基因表達陽性的肺癌細(xì)胞有特異性殺傷作用；蛋白交叉誘導(dǎo)的CTL也有一定的殺傷作用；特異性CTL對正常肺組織不產(chǎn)生殺傷作用。 3.NY-ESO-1和XAGE-1b

13、蛋白聯(lián)合負(fù)載DCs，可為CTL提供更多的抗原表位信息，誘導(dǎo)的特異性CTL對兩個基因表達均陽性的肺癌細(xì)胞的殺傷活性最強，在效靶比為80∶1時可達(51.45±3.5)％。 創(chuàng)新點 1.本研究是國內(nèi)首例表達完整全長、可溶性NY-ESO-1和XAGE-1b蛋白的研究，也是國內(nèi)外首例用基因工程合成的NY-ESO-1和XAGE-1b抗原蛋白負(fù)載DCs構(gòu)建肺癌疫苗的研究，肯定了以腫瘤-睪丸抗原蛋白構(gòu)建肺癌疫苗的可行性和有效性，為無法

14、獲取腫瘤組織標(biāo)本的肺癌患者免疫治療提供了一條新途徑。 2.本研究在國內(nèi)首先報道了無血清DCs專用培養(yǎng)基聯(lián)合改良的促成熟細(xì)胞因子組合快速培養(yǎng)臨床級DCs的方法，該方法避免了含血清培養(yǎng)基的諸多弊端，具有穩(wěn)定性好、可控性強、重復(fù)性高、安全、高效等優(yōu)點，快速培養(yǎng)方案縮短了DCs體外生長時間，減少DCs受到污染的機會，降低DCs在體外生存時間過久發(fā)生活性改變的可能，該方法培養(yǎng)的DCs更適合臨床應(yīng)用。 3.本研究在國內(nèi)首先報道了Ac