凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗抗肺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載的樹突狀細(xì)胞疫苗抗肺癌的實(shí)驗(yàn)研究 背景與目的：樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)是目前已知功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，并能有效刺激初始免疫應(yīng)答和記憶免疫應(yīng)答，是啟動(dòng)、調(diào)控并維持特異性免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。腫瘤患者體內(nèi)往往存在DCs功能缺陷，無法有效的提呈腫瘤抗原給T細(xì)胞，造成了免疫忽視或免疫逃逸，從而促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)。通過體外制備腫瘤抗原特異性的DCs疫苗回輸體內(nèi)可能會(huì)改變這一狀況。本實(shí)驗(yàn)從健

2、康人外周血中誘導(dǎo)DCs，通過凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載聯(lián)合CD40單抗促進(jìn)DCs成熟構(gòu)建DCs疫苗，并用DCs疫苗激活抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)，觀察其體內(nèi)外抗肺癌的特性。 方法：采用常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，培養(yǎng)2小時(shí)后貼壁細(xì)胞采用含GM-CSF(100~g／L)、IL-4(50~g

3、／L)、10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)DCs，在DCs培養(yǎng)的第6天，以誘導(dǎo)凋亡的A549進(jìn)行抗原負(fù)載(DCs：凋亡細(xì)胞=5：1)，24h后加入激發(fā)型CD40單克隆抗體(5mg／L)繼續(xù)誘導(dǎo)2d，誘導(dǎo)DCs成熟；收集成熟的DCs與自體T細(xì)胞按l：50的比例混合共育7天，誘導(dǎo)抗原特異性的CTL細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型變化；四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測(cè)定細(xì)胞毒活性；于裸鼠的的右腋皮下注射處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞5×106個(gè)／0．

4、2ml，第16天選擇荷瘤大小相似的裸鼠12只隨機(jī)分為2組，每組6只。①生理鹽水對(duì)照組：給予腫瘤局部注射生理鹽水0．2ml作為空白對(duì)照；②CTL治療組：給予腫瘤局部注射CTL1×107個(gè)／0．2ml；每周治療1次，連續(xù)治療3次。從治療開始每7d測(cè)量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b)1次，腫瘤體積=0．5×a×b2，觀察腫瘤生長(zhǎng)的情況。 結(jié)果：凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載可使DCs上調(diào)表達(dá)CDla、CD80、CD83、CD86和HLA-DR，

5、聯(lián)合CD40mAb可進(jìn)一步促進(jìn)DCs的成熟；成熟DCs和自體的T細(xì)胞共育活化生成抗原特異性CTL；與未活化前相比，CTL的CD8+T細(xì)胞大幅度上調(diào)，并上調(diào)表達(dá)CD3、CD25、CD28、CD8／CD28分子；CTL對(duì)A549具有高效特異的殺傷力，明顯強(qiáng)于CTL對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的作用(P

6、照組腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)較快，CTL組腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑制，接種肺癌細(xì)胞A549第44天后對(duì)照組、CTL組兩組腫瘤體積分別為(0．68±O．n)cm3、(O．14±O．10)cm3，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

7、ine-inducedkiller,CIK)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜表面分子，具有增殖活性高、殺瘤活性強(qiáng)、殺瘤譜廣及對(duì)正常骨髓造血影響輕微等多種優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是新一代過繼免疫治療的首選方案。樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，能有效刺激初始免疫應(yīng)答和記憶免疫應(yīng)答，并且能夠提高效應(yīng)細(xì)胞的抗瘤活性。本實(shí)驗(yàn)將DCs和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察共培養(yǎng)的DCs和CIK細(xì)胞(DC-CIK細(xì)胞)的細(xì)胞表型、

8、增殖活性及體內(nèi)外的抗肺癌作用。 方法：采用常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，培養(yǎng)2小時(shí)后貼壁細(xì)胞采用含GM-CSF(100~g／L)、IL-4(50~g／L)、10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)DCs，在DCs培養(yǎng)的第6天，以誘導(dǎo)凋亡的A549進(jìn)行抗原負(fù)載(DCs：凋亡細(xì)胞=5：1)，24h后加入激發(fā)型CD40單克隆抗體(5mg幾)繼

9、續(xù)誘導(dǎo)2d，誘導(dǎo)DCs成熟；收集非粘附性細(xì)胞(pefipherflbloodlymphocyte，PBL)，第O天添加IFN-71000U/ml，第1天添加抗CD3單抗250ng/ml、IL-2300U/ml。每3天調(diào)整細(xì)胞密度，更換培養(yǎng)基，并補(bǔ)加IL-2300U/ml：將成熟的DCs和培養(yǎng)9天的CIK細(xì)胞按1：10比例共培養(yǎng)5天獲得DC-CIK細(xì)胞。流式細(xì)胞儀測(cè)DC-CIK細(xì)胞表型CD3、CD25、CD4、CD8、CD56的變化，四甲

10、基偶氮唑鹽(MTT)法測(cè)定其體外的細(xì)胞毒活性；于BALB／C裸鼠的的右腋皮下注射處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞5×1003'／只，第16天選擇荷瘤大小相似的裸鼠18只隨機(jī)分為3組：①生理鹽水對(duì)照組；②CIK治療組；③CIK-DC治療組，每組6只。治療組于腫瘤局部注射相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞1×107個(gè)／只，體積均為0．2ml／R，對(duì)照組于腫瘤局部注射生理鹽水0．2ml／只；每周治療1次，連續(xù)治療3次。從治療開始每7天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大縱徑(a