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文檔簡介
1、肝癌是一種常見的惡性腫瘤,預(yù)后非常差,許多患者在初次診斷時已經(jīng)處于進(jìn)展期或出現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移,只有很少一部分患者適合手術(shù)治療。隨著免疫學(xué)和腫瘤生物學(xué)的發(fā)展,免疫治療作為腫瘤治療的一種新策略??鼓[瘤免疫的重要目的就是誘導(dǎo)針對腫瘤的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和輔助性T(Th)淋巴細(xì)胞。而獲得腫瘤特異性CTL和Th細(xì)胞的一個重要方法就是負(fù)載各種腫瘤抗原的抗原呈遞細(xì)胞,如樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的職業(yè)
2、抗原提呈細(xì)胞,可攝取、加工、提呈抗原,在體內(nèi)、體外激發(fā)初次和繼發(fā)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。近年來,DC越來越多地被用于抗腫瘤免疫。在DC免疫治療試驗研究中已成功地誘導(dǎo)出抗腫瘤反應(yīng),并且在一些臨床試驗中也表現(xiàn)出很好的效果。 目前已發(fā)現(xiàn)多種可被CD8+CTL識別的腫瘤抗原,但對于大多數(shù)腫瘤來說,仍無有效的腫瘤相關(guān)抗原或特異性抗原。另外,由于腫瘤突變,針對單一抗原的免疫治療有時并不能發(fā)揮其應(yīng)有的作用。對于某些未知特異性抗原或相關(guān)性抗原的腫瘤,
3、為使DC能夠負(fù)載更多的抗原,利于臨床應(yīng)用,人們研究了多種抗原的制備方法,例如:射線照射后的腫瘤細(xì)胞,腫瘤裂解物,腫瘤細(xì)胞來源的RNA,凋亡小體以及腫瘤來源的exosome等。這些方法,有可能通過MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ兩種途徑呈遞大量的抗原,誘導(dǎo)多價免疫反應(yīng),并且誘導(dǎo)的特異性CTL和Th細(xì)胞有可能通過協(xié)同作用而進(jìn)一步放大免疫學(xué)效應(yīng)。 選用全細(xì)胞性抗原作為肝癌DC免疫治療的抗原負(fù)載方式,是必需的且具有一定優(yōu)勢。理論上,這種抗原負(fù)載方
4、式,包括所有已知和未知的抗原,都有被DC呈遞到細(xì)胞表面的可能,因而能夠誘導(dǎo)出范圍更大,程度更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。這一點,對于肝癌這樣缺乏明確腫瘤抗原的惡性腫瘤來說,是尤為重要的。因此本研究選擇全細(xì)胞抗原作為DC抗原負(fù)載方式,包括腫瘤細(xì)胞裂解物致敏DC、腫瘤細(xì)胞和DC融合以及腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC等3種方式。我們對以3種形式負(fù)載抗原的DC瘤苗體外抗腫瘤活性進(jìn)行了比較研究,并對它們體外誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)的異同進(jìn)行分析。 目的:本研究選擇不
5、同形式的全細(xì)胞腫瘤抗原負(fù)載DC,包括腫瘤細(xì)胞裂解物致敏DC,腫瘤細(xì)胞和DC融合,以及腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC等。對這3種抗原負(fù)載形式的DC瘤苗體外抗腫瘤活性進(jìn)行比較,分析其體外誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的異同,以期選擇更好的適宜臨床應(yīng)用的DC瘤苗。 方法: 1.肝癌患者DC的誘導(dǎo)及鑒定:選擇肝癌患者及正常人外周血,血細(xì)胞分離機(jī)分離富集外周血PBMC,經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心、聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板貼壁純化后,加入含GM-CSF和IL-4
6、的X-vivo15培養(yǎng)液聯(lián)合誘導(dǎo)DC分化,誘導(dǎo)d6加入TNF-α促進(jìn)DC成熟。分別以倒置顯微鏡、電子顯微鏡觀察DC形態(tài)變化;FCM檢測細(xì)胞表型變化;MTT法檢測DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力。 2.腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒效應(yīng):綠色熒光蛋白質(zhì)粒載體pEGFP-C3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2,Trizol法提取篩選后細(xì)胞HepG2-GFP總RNA;分離肝癌患者外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)DC,總RNA轉(zhuǎn)染DC,熒
7、光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后DC表型變化;ELISA法檢測轉(zhuǎn)染前后上清中IL-12變化情況;取患者外周靜脈血單個核細(xì)胞(PBMC)中非貼壁細(xì)胞(淋巴細(xì)胞,L),調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,以含IL-2、10%FCS的RPMI1640培養(yǎng);將RNA-DC以5×104/mL密度加入上述淋巴細(xì)胞中,共同孵育72h(設(shè)未致敏DC組和單獨淋巴細(xì)胞組為對照),72h后再次加入同劑量DC,孵育72h,收獲細(xì)胞分別稱為RNA-DC
8、-L、DC-L和L。以RNA-DC-L、DC-L和L作為效應(yīng)細(xì)胞,肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721及白血病細(xì)胞株K562為靶細(xì)胞,以不同效靶比(5:1、10:1、20:1)接種于96孔板,48h后MTT法測定效應(yīng)細(xì)胞對各腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。 3.三種全細(xì)胞性瘤苗體外細(xì)胞毒活性比較:分別以肝癌細(xì)胞株HepG2凍融抗原致敏患者DC(Lys-DC),HepG2總RNA轉(zhuǎn)染DC(RNA-DC),HepG2與DC融合(Fus-DC)
9、作為刺激細(xì)胞,取患者外周靜脈血單個核細(xì)胞(PBMC)中非貼壁細(xì)胞(淋巴細(xì)胞,L),調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,以含IL-2、10%FCS的RPMI1640培養(yǎng);將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以5×104/mL密度分別加入上述淋巴細(xì)胞中,共同孵育72h(設(shè)未致敏DC組和單獨淋巴細(xì)胞組為對照),再次加入同劑量DC,孵育72h,收獲細(xì)胞分別稱為Lys-DC-L、RNA-DC-L、Fus-DC-L、DC-L和L。以Lys-DC-
10、L、RNA-DC-L、Fus-DC-L、DC-L和L作為效應(yīng)細(xì)胞,肝癌細(xì)胞株HepG2為靶細(xì)胞,以效靶比20:1接種于96孔板,48h后MTT法測定效應(yīng)細(xì)胞對各腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。 4.三種瘤苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞功能比較:分離CD8+T細(xì)胞,以含IL-2(400U/mL)、10%FCS的RPMI1640重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板;將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以5×104/
11、mL密度分別加入上述淋巴細(xì)胞中,共同孵育72h(設(shè)未致敏DC組和單獨淋巴細(xì)胞組為對照),72h后再次加入同劑量DC,孵育72h,收獲細(xì)胞分別稱為Lys-DC-T、RNA-DC-T、Fus-DC-T、DC-T和T。收集各組細(xì)胞上清,應(yīng)用IFN-γELISA檢測試劑盒檢測IFN-γ分泌。 5.三種瘤苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞功能比較:分離CD4+T細(xì)胞,以含IL-2(400U/mL)、10%FCS的RPMI1640重懸,調(diào)整細(xì)胞
12、密度為2×105/mL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以2×104/mL密度分別加入上述淋巴細(xì)胞中,共同孵育72h(設(shè)未致敏DC組和單獨淋巴細(xì)胞組為對照),72h后再次加入同劑量DC,孵育96h后,MTT法檢測各種瘤苗刺激自體CD4+T細(xì)胞增殖的能力。 結(jié)果: 1.肝癌患者DC鑒定:誘導(dǎo)后,患者DC顯示出典型的形態(tài)及表型特征。其中,誘導(dǎo)d8(加TNF-α活化48h),各抗原表達(dá)量明顯升
13、高,分別為:CD83(95.94±1.78)%、CD86(96.33±2.19)%、CD80(94.19±1.89)%、HLA-DR(93.71±3.67)%,為典型DC表型;健康對照DC各抗原表達(dá)量為CD83(94.78±3.67)%、CD86(94.65±2.50)%、CD80(94.70±1.69)%、HLA-DR(93.06±3.72)%,二者間無顯著性差異(P>0.05)?;旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示,患者DC具有高效地刺激同種異
14、體淋巴細(xì)胞增殖的能力,其刺激指數(shù)(SI)與健康對照DC的SI無顯著差異(P>0.05)。 2.腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒效應(yīng):pEGFP-C3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2后可得到穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞HepG2-GFP,熒光顯微鏡下所有細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光,流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白表達(dá)99%以上;HepG2-GFP總RNA轉(zhuǎn)染的DC熒光顯微鏡下呈綠色熒光,流式細(xì)胞儀檢測GFP表達(dá)陽性細(xì)胞比率可達(dá)50%以上,轉(zhuǎn)染后D
15、C表面分子CD80(13.2%上升至86.7%),HLA-DR(38.9%上升至97.9%),CD83(0.9%上升至97.1%),CD86(31.2%上升至92.5%)表達(dá)明顯升高,上清IL-12分泌量顯著增高(61.3±8.1ng/L→287.4±29.3ng/L,P<0.05);RNA-DC-L對HepG2的殺傷率明顯高于對另一肝癌細(xì)胞SMMC7721和白血病細(xì)胞K562的殺傷率,對SMMC7721的殺傷率也高于對白血病細(xì)胞K56
16、2的殺傷率。 3.三種全細(xì)胞性瘤苗體外細(xì)胞毒活性比較:Lys-DC-L、Fus-DC-L、RNA-DC-L組均顯示對HepG2高效特異的殺傷活性,顯著高于DC-L組和單純L組;但Fus-DC-L、RNA-DC-L對HepG2的殺傷率明顯高于Lys-DC-L組;而Fus-DC-L、RNA-DC-L組對HepG2的殺傷率無明顯區(qū)別。 4.三種瘤苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞功能比較:Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC刺
17、激的CD8+T細(xì)胞組IFN-γ分泌顯著高于DC刺激的CD8+T細(xì)胞組和單純CD8+T細(xì)胞組;但Fus-DC、RNA-DC刺激組IFN-γ分泌顯著高于Lys-DC刺激組;而Fus-DC、RNA-DC刺激組IFN-γ分泌無明顯區(qū)別。 5.三種瘤苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞功能比較:Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC組刺激自體CD4+T細(xì)胞增殖功能顯著高于DC組;但Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC刺激自體CD4+T細(xì)胞
18、增殖功能無明顯區(qū)別。 結(jié)論: 1.從肝癌患者外周血單個核細(xì)胞,可成功誘導(dǎo)出功能正常的樹突狀細(xì)胞,肝癌患者體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC,可以應(yīng)用于肝癌的免疫治療。 2.腫瘤總RNA轉(zhuǎn)染的DC以及融合瘤苗能更有效的誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng),是更為有效的DC免疫治療方式。腫瘤總RNA轉(zhuǎn)染操作簡單,應(yīng)用裸RNA轉(zhuǎn)染方法對細(xì)胞無損傷,并且在某些腫瘤細(xì)胞過少或腫瘤組織過小患者中,可以通過PCR方法擴(kuò)增得到大量RNA,因此更
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