增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染兔間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗研究.pdf

1、目的：應(yīng)用G-CSF動員骨髓干細(xì)胞后分離外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，并體外培養(yǎng)擴(kuò)增，經(jīng)鑒定后用重組腺病毒(攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因)轉(zhuǎn)染，建立表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞系。 方法：應(yīng)用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)兔外周血MSCs，并用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，測定原代及傳代細(xì)胞的生長曲線；MSCs經(jīng)液氮凍存半年復(fù)蘇，觀察細(xì)胞凍存前后的生長狀況，并用臺盼藍(lán)法測定其存活率；取培養(yǎng)第3代MSCs以CD34、CD45和

2、CD44的表達(dá)作流式細(xì)胞儀鑒定；以表達(dá)EGFP的腺病毒載體(Ad-CMV-EGFP)轉(zhuǎn)染MSCs，熒光倒置顯微鏡下觀察其瞬時表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果： ①M(fèi)SCs于體外培養(yǎng)2小時開始貼壁生長，9～12天可見有集落形成，14～20天可達(dá)到80％～90％融合，倒置相差顯微鏡見細(xì)胞形態(tài)為梭形、多角形及紡錘狀等。傳代MSCs變?yōu)樾螒B(tài)均一、排列有序的長梭形細(xì)胞，增殖活躍； ②MSCs生長曲線呈“s”型，傳代細(xì)胞平均倍增時間為

3、30h； ③MSCs經(jīng)6個月凍存后復(fù)蘇培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)及生長狀況與凍存前無明顯差別，均呈長梭形，細(xì)胞生長增殖旺盛； ④流式細(xì)胞儀檢測MSCs表面抗原CD34、CD45呈陰性表達(dá)，CD44呈陽性表達(dá)； ⑤MSCs經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染后24h即可表達(dá)EGFP，5d表達(dá)最強(qiáng)，此后逐漸減弱，到4周時仍可見少量表達(dá)； ⑥測定腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs效率約為60％。 結(jié)論： ①采用密度梯度離心法和貼壁法可以有效獲得應(yīng)