甘藍(lán)型油菜及其親本物種TT12基因家族的克隆與比較基因組學(xué)研究.pdf

1、十字花科中，擬南芥（Arabidopsis thaliana）是重要的模式植物，蕓薹屬含有多種重要的油料、蔬菜和觀賞園藝植物。蕓薹屬內(nèi)部的物種間以及蕓薹屬與擬南芥之間的比較基因組學(xué)研究，是理論研究一個(gè)熱點(diǎn)，也是將擬南芥模式植物中功能基因的重要研究成果應(yīng)用到蕓薹屬作物進(jìn)行遺傳改良的有力工具。甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）是由甘藍(lán)（B．oleracea）和白菜型油菜（B．rapa）融合而成的異源四倍體。比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)，蕓薹屬基

2、本種在進(jìn)化中相對(duì)于擬南芥發(fā)生了基因組水平的三倍化，并伴隨發(fā)生了局部區(qū)段的丟失、再加倍和重排。目前的比較基因組學(xué)研究多集中于通過(guò)分子標(biāo)記手段，從宏觀上揭示物種間在基因組和染色體水平的共線(xiàn)性程度，而基于功能基因比較克隆的比較基因組學(xué)和比較生物學(xué)研究對(duì)于油菜等蕓薹屬作物具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。 黃籽性狀具有綜合品質(zhì)優(yōu)勢(shì)和良好的市場(chǎng)前景，是世界油菜研究中的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。白菜型油菜和甘藍(lán)中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但甘藍(lán)型油菜卻

3、沒(méi)有，而通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交等方法創(chuàng)造黃籽材料的選育周期長(zhǎng)、效率低，尤其是黃籽表型易受環(huán)境影響而不穩(wěn)定。當(dāng)前急需對(duì)甘藍(lán)型油菜和其親本物種中與黃籽性狀相關(guān)的重要功能基因進(jìn)行全長(zhǎng)序列的比較克隆，然后進(jìn)行比較基因組學(xué)和比較生物學(xué)研究，揭示這3個(gè)物種間在黃籽性狀上的分子遺傳學(xué)機(jī)理，并通過(guò)基因工程改良甘藍(lán)型油菜的籽色性狀。 擬南芥等植物中種皮色素的主要成分是原花青素單體的聚合物，是由苯丙烷－類(lèi)黃酮途徑形成的。該途徑的眾多功能基因中，擬南芥TT12

4、基因（AtTT12）在種皮中特異表達(dá)，編碼一種類(lèi)多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)種皮色素向液泡的轉(zhuǎn)運(yùn)，其單基因失活突變即可導(dǎo)致由野生型的深褐色種子轉(zhuǎn)變?yōu)橥该鞣N皮（黃籽）。油菜與擬南芥同屬十字花科，種皮色澤等性狀也相似，因此本研究克隆了甘藍(lán)型油菜和其親本物種中TT12基因的全長(zhǎng)序列，進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析。 1）率先克隆了甘藍(lán)型油菜及其2個(gè)親本物種的TT12基因（家族） 本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，率先克隆了甘藍(lán)型油菜及其親本物

5、種白菜型油菜和甘藍(lán)中TT12基因（家族）的全長(zhǎng)cDNA和基因組序列。甘藍(lán)型油菜BnTT12—1基因全長(zhǎng)2712bp，mRNA全長(zhǎng)1747bp（不計(jì)polyA尾巴，下同）：BnTT12—2基因全長(zhǎng)3000bp，mRNA全長(zhǎng)1678bp；白菜型油菜BrTT12基因全長(zhǎng)2711bp，mRNA全長(zhǎng)1747bp；甘藍(lán)BoTT12基因全長(zhǎng)3062bp，mRNA全長(zhǎng)1739bp。該結(jié)果為深入研究蕓薹屬TT12基因的功能、進(jìn)化、調(diào)控模式奠定了基礎(chǔ)，也為

6、通過(guò)對(duì)TT12基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)抑制（反義、RNA干擾）或TILLING突變體篩選來(lái)創(chuàng)造新型黃籽油菜新材料奠定了基礎(chǔ)。 2） BnTT12—1、BnTT12—2、BrTT12和BoTT12符合TT12基因的典型特征 它們的基因組序列都有7個(gè)內(nèi)含子，位置都與AtTT12的一致，都符合GT...AG的內(nèi)含子剪切位點(diǎn)邊界序列特征。在BnTT12—1、BnTT12—2、BrTT12和BoTT12 mRNA的62-1585、17—1

7、540、60—1583和78—1601bp處都有一個(gè)1524bp的ORF（含終止密碼子，下同），5'UTR分別為61、16、59和77bp，3'UTR分別為162、138、164和138bp。它們的polyA加尾信號(hào)AAATAAA分別位于最末polyA加尾位點(diǎn)上游間隔96、83、98和83bp處。 與AtTT12相似，推導(dǎo)的BnTT12—1、BnTT12—2、BrTT12和BoTT12蛋白均為507 aa。BnTT12—1的計(jì)算

8、分子量Mw=55．080 kDa，等電點(diǎn)pI=3．24； BnTT12—2的Mw=55．168 kDa，pI=3．24； BrTT12的Mw=55．199 kDa，pI=4．24； BoTT12的Mw=55．128 kDa，pI=3．24。它們是典型的酸性蛋白。它們均以亮氨酸含量最高（15．11％）。BnTT12—1、BnTT12—2和BoTT12有21個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，BrTT12則有19個(gè)，所以磷酸化可能參與它們的蛋白活性調(diào)節(jié)。預(yù)

9、測(cè)它們沒(méi)有信號(hào)肽或信號(hào)錨定，很可能定位于質(zhì)膜，而且都有9個(gè)可能的跨膜區(qū)，這與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtTT12相似。 它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，均以α螺旋為主（64．6g％、62．52％、64．8g％、64．10％），其次是隨機(jī)卷曲（20．71％、21．10％、19．72％、18．93％）。整個(gè)分子平均分布大量的α—螺旋，但其中在蛋白的中部偏N末端、偏C末端以及C末端，都有較大的α－螺旋，同時(shí)還有一些小的α－螺旋分散在整個(gè)分子中，而延伸鏈、

10、β－轉(zhuǎn)角和隨機(jī)卷曲的分布則相對(duì)較為均勻，這與TT12等MATE家族跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基本特征一致。未能預(yù)測(cè)出它們蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 核苷酸序列和氨基酸序列的BLAST分析、序列兩兩比對(duì)和多重比對(duì)、序列的系統(tǒng)發(fā)生分析均表明，它們與AtTT12有最高的相似性。從基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、序列同源性三大方面分析，均顯示它們是AtTT12的垂直同源基因，具有TT12的典型特征。 3）蕓薹屬基本種中TT12基因數(shù)與擬南芥相比并沒(méi)有發(fā)生三倍化

11、 本研究通過(guò)竭盡式克隆，從甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜和甘藍(lán)中分別只克隆到了2條、1條和1條TT12基因。Southern blot雜交結(jié)果所指示的同源拷貝數(shù)與基因家族成員數(shù)的序列結(jié)構(gòu)非常吻合。因此，蕓薹族的公共祖先與擬南芥分開(kāi)后在TT12位點(diǎn)上很可能并沒(méi)發(fā)生基因數(shù)目的三倍化，或者在基因加倍后不久隨即發(fā)生了多數(shù)成員的丟失，從而使蕓薹屬二倍體基本種中只有1條TT12基因。 4）白菜型油菜和甘藍(lán)確實(shí)為甘藍(lán)型油菜的供體親本

12、 BnTT12-1和BrTT12之間基因組序列的一致性達(dá)到96．5％，BnTT12—2和BoTT12之間達(dá)到99．4％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甘藍(lán)型油菜種內(nèi)成員BnTT12—1與BnTT12—2之間的一致性，氨基酸水平上的趨勢(shì)也是如此。核酸水平和氨基酸水平的系統(tǒng)發(fā)生聚類(lèi)顯示，BnTT12—1和BrTT12更緊密，BnTT12—2則和BoTT12更緊密。此外，從內(nèi)含子的一致性、5'UTR中的oligo A的位置與長(zhǎng)度、基因序列中的特征性變異堿基、氨基酸

13、序列中的特征性交異氨基酸等方面來(lái)看，都表明BnTT12—1對(duì)應(yīng)于BrTT12，BnTT12—2對(duì)應(yīng)于BoTT12，說(shuō)明甘藍(lán)和白菜型油菜的確為甘藍(lán)型油菜提供了遺傳物質(zhì)。本研究從功能基因家族成員的全長(zhǎng)序列比較克隆的角度，為揭示甘藍(lán)型油菜與其親本物種間的進(jìn)化關(guān)系提供了直觀而具體的分子證據(jù)。 5）揭示了TT12基因的一些新的結(jié)構(gòu)特征 蕓薹屬4個(gè)TT12基因的5'UTR中均存在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的多態(tài)性，BnTT12—1中為A1、A6，

14、BnTT12—2中為A1、 A2，BrTT12中為A1、G3，BoTT12中為A1、A5、A30、 A35、G59。它們的3' UTR中也都存在加尾位點(diǎn)的多態(tài)性，BnTT12—1中為C2627、T2631、C2694、T2712，BnTT12—2中為T(mén)2929、C2939、 C3000，BrTT12中為C2624、C2688、C2691、T2711，BoTT12中為T(mén)2994、T3040、C3062。它們也許代表了一種順式調(diào)控方式，也許

15、只是轉(zhuǎn)錄起始和poy A加尾過(guò)程中的允許誤差。 ATG上游的oligoA結(jié)構(gòu)是十字花科TT12基因的一個(gè)保守性基序。BnTT12—1中為22bp，與ATG間隔7bp； BnTT12—2中為10bp，與ATG間隔6bp，BrTT12中為25bp，與ATG間隔7bp，BoTT12中為10bp，與ATG間隔6bp，AtTT12中為10bp，與ATG間隔21bp。這種oligo A結(jié)構(gòu)有可能在mRNA翻譯時(shí)有助于核糖體的特異識(shí)別與結(jié)合