甘藍(lán)型油菜硫苷轉(zhuǎn)運(yùn)基因BnGTRs的克隆與初步研究.pdf

1、油菜是我國(guó)主要油料作物之一。油菜籽榨油后的餅粕是良好的禽畜類(lèi)動(dòng)物蛋白飼料。然而餅粕中含有較多硫苷及水解產(chǎn)物，會(huì)對(duì)牲畜產(chǎn)生毒害作用。另一方面，硫苷及其水解產(chǎn)物是植物防御體系中的重要物質(zhì)，其含量的高低能影響植物抗蟲(chóng)抗病性。運(yùn)用傳統(tǒng)育種方法培育的低硫苷油菜材料，其葉片莖稈硫苷含量伴隨著種子硫苷含量的減少而減少，導(dǎo)致抗蟲(chóng)抗病性的降低，影響了低硫苷低芥酸油菜的推廣。因此通過(guò)控制硫苷在油菜不同組織中的分配獲得葉片等營(yíng)養(yǎng)器官硫苷含量高而籽粒中硫苷含量

2、低的材料，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究分析了不同甘藍(lán)型油菜材料硫苷種類(lèi)和含量差異，并依據(jù)前人對(duì)擬南芥硫苷轉(zhuǎn)運(yùn)子基因AtGTRs的研究，利用GENE RACE方法克隆了甘藍(lán)型油菜中的BnGTRs基因，并通過(guò)amiRNA敲除技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因T0代，通過(guò)考察T0代植株中BnGTRs的表達(dá)和葉片硫苷含量，初步探討了BnGTRs的功能。主要結(jié)果如下:
　　1.高硫、中硫、低硫材料中葉片硫苷和籽粒硫苷含量的差異分析
　　高硫、中硫和低硫材料

3、葉片總硫苷的差異在于脂肪族硫苷，主要是2-羥基-3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷的含量差異，吲哚族硫苷的差異不明顯。
　　在籽粒硫苷的比較中，高硫、中硫和低硫材料總硫苷含量的差異主要是脂肪族硫苷——2-羥基-3-丁烯基脫硫硫苷，吲哚族硫苷的差異不明顯。
　　2.BnGTRs基因的克隆和結(jié)構(gòu)特征
　　采用同源克隆法，利用GENE RACE技術(shù)，在甘藍(lán)型油菜中克隆分離了2個(gè)硫苷轉(zhuǎn)運(yùn)子基因BnGTR1和BnGTR2。兩個(gè)基因O

4、RF均為1839bp，編碼612個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子分別為T(mén)GA和TAA，序列一致性為90％。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，BnGTRs為擬南芥AtGTR2基因的同源序列。與AtGTRs相似，BnGTRs均含有PTR跨膜結(jié)構(gòu)域，后經(jīng)GFP熒光亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)可能定位在質(zhì)膜上。這些結(jié)果初步說(shuō)明BnGTRs可能為硫苷轉(zhuǎn)運(yùn)子。
　　3.BnGTRs的功能分析
　　利用amiRNA技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體材料得到轉(zhuǎn)基因T

5、0代，對(duì)T0代植株葉片進(jìn)行Realtime-PCR分析，發(fā)現(xiàn)在amiRNA特異沉默下，BnG TR2下調(diào)表達(dá)，而B(niǎo)nGTR1則沒(méi)有類(lèi)似的規(guī)律，說(shuō)明amiRNA主要對(duì)BnGTR2表達(dá)有影響。對(duì)T0代植株葉片硫苷含量進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照相比，總硫苷含量顯著降低，其中脂肪族硫苷含量顯著減少，而吲哚族硫苷含量無(wú)明變化。
　　根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，在BnGTRs的兩個(gè)同源序列中，BnGTR2與硫苷的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，而B(niǎo)nGTR1與