甘藍型油菜BnPPT1基因的克隆及其功能研究.pdf

1、磷酸烯醇式丙酮酸/磷酸轉運子基因(Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator1PPT1)是細胞質體碳水化合物轉運的一個關鍵基因,在植物莽草酸代謝和脂肪酸生物合成途徑中起著重要作用。根據(jù)模式植物擬南芥PEP轉運子AtPPT1基因序列與油菜數(shù)據(jù)庫BBSRC BrassicaDB中相應ESTs設計全長引物,以甘藍型油菜(Brassica napus)幼嫩葉片基因組DNA和種子cDNA為模板,克隆甘藍型

2、油菜PEP轉運子基因全長序列,命名為BnPPT1。該基因gDNA全長為2075bp,含有8個內(nèi)含子,編碼區(qū)長度為1224bp,編碼407個氨基酸。序列比對表明,BnPPT1與同屬于十字花科擬南芥AtPPT1轉運子同源性很高,僅有個別氨基酸的差異；進化分析結果進一步說明兩者近親緣關系。以BnPPT1全長cDNA為目標序列,構建組成性強啟動子CamV35S驅動的與報告基因eGFP融合的植物表達載體BPE,同時以-401bp的BnPPT1片斷

3、為靶片斷,構建CamV35S啟動子驅動的RNAi載體BPTi,通過花粉管浸泡法導入到擬南芥,進行融合蛋白亞細胞定位觀察以及功能表達驗證；亞細胞定位分析結果表明BnPP71基因編碼蛋白與ATPPT1蛋白一樣定位于細胞質體,且以BnPPT1基因部分cDNA片斷構建的RNAⅰ載體BPTⅰ的轉基因擬南芥表現(xiàn)出內(nèi)源基因AtPPT1的表達抑制,出現(xiàn)了明顯的低葉綠素表型,而BPE轉基因能完全恢復AtPPT1基因功能缺失擬南芥突變體表型。這些研究結果不

4、僅說明了BnPPT1基因與擬南芥AtPPT1基因高度同源,同時也表明兩者可能具有相同的生物學功能,由此推測在甘藍型油菜中,BnPPT1基因具有提供油脂/蛋白質生物合成的重要底物PEP這一十分重要的生物學作用。采用半定量RT-PCR分析表明,BnPPT1基因在油菜各器官中表達差異很大,在幼嫩的子葉、莖以及中早期發(fā)育時期種子中有較高豐度的表達,在種子中表達豐度隨發(fā)育時期逐步升高。但在成熟后期沒有表達,暗示該基因在油菜籽粒油份等物質積累中有重

5、要功能。因此,通過農(nóng)桿菌轉染油菜下胚軸的技術,將構建好的BPE載體導入了本研究室前期獲得高油份甘藍型油菜中,PCR檢測以及除草劑抗性篩選表明成功獲得了轉基因陽性株系32份；T0代單株套袋成熟種子油份以及脂肪酸成分的測定結果表明轉基因T0代植株油份分布出現(xiàn)類似正態(tài)分布的趨勢,與轉基因陰性對照相比,脂肪酸組分沒有明顯變化,而油份含量有所增高,最高增加了10.5個百分點。這些T0代植株出現(xiàn)類似正態(tài)分布的油份分布趨勢說明,目標基因在不同轉基因油