甘藍(lán)型油菜裂角相關(guān)基因bnrpl的克隆與分析

1、中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｉｌＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓ２０１３，３５（１）：０１７－０２３ｄｏｉ：１０７５０５／ｊｉｓｓｎ１００７－９０８４２０１３０１００３甘藍(lán)型油菜裂角相關(guān)基因ＢｎＲＰＬ的克隆與分析彭鵬飛，胡瓊，李云昌，付麗，陳玉峰，劉佳，梅德圣（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢，４３００６２）摘要：為鑒定甘藍(lán)型油菜裂角相關(guān)基因，基于候選基因途徑，利用同源克隆

2、結(jié)合ＲＡＣＥ方法，在甘藍(lán)型油菜易裂角品系Ｒ２中擴(kuò)增出了兩個(gè)ＲＰＬ基因的全長(zhǎng)ｃＤＮＡ序列，其中一條序列長(zhǎng)度為２０６８ｂｐ，開(kāi)放閱讀框序列位置為１５４－１９１１位，總長(zhǎng)為１７５８ｂｐ，命名為ＢｎＲＰＬａ。另一條序列全長(zhǎng)為２０４１ｂｐ，開(kāi)放閱讀框序列位置為１５４－１８８７位，總長(zhǎng)為１７３４ｂｐ，命名為ＢｎＲＰＬｃ。分析表明利用ＰＣＲ方法得到的ＢｎＲＰＬ基因由３個(gè)內(nèi)含子和４個(gè)外顯子組成，與擬南芥ＲＰＬ基因結(jié)構(gòu)相似。氨基酸序列同源性分析表明，Ｂｎ

3、ＲＰＬ與擬南芥ＡｔＲＰＬ和荒野獨(dú)行菜（Ｌｅｐｉｄｉｕｍｃａｍｐｅｓｔｒｅ）的ＲＰＬ具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示ＲＰＬ蛋白在雙子葉植物和單子葉植物的分化過(guò)程中發(fā)生了序列變異。ＢｎＲＰＬ基因存在時(shí)空表達(dá)的組織特異性，在發(fā)育的角果（花后２０ｄ）表達(dá)量最大；成熟后期在角果皮和假隔膜中表達(dá)，在種子中不表達(dá)。關(guān)鍵詞：油菜；角果皮；假膈膜；ＲＰＬ基因；ＲＡＣＥ；序列分析；表達(dá)中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ５６５４０３文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：１００７－９０８

4、４（２０１３）０１－００１７－０７ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｐｏｄｓｈａｔｔｅｒｉｎｇｇｅｎｅＢｎＲＰＬｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＰＥＮＧＰｅｎｇ－ｆｅｉ，ＨＵＱｉｏｎｇ，ＬＩＹｕｎ－ｃｈａｎｇ，ＦＵＬｉ，ＣＨＥＮＹｕ－ｆｅｎｇ，ＬＩＵＪｉａ，ＭＥＩＤｅ－ｓｈｅｎｇ（ＯｉｌＣｒｏｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＫｅｙＬ

5、ａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＯｉｌＣｒｏｐｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｕｈａｎ４３００６２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｏｆａｐｕｔａｔｉｖｅｐｏｄｓｈａｔｔｅｒｉｎｇｇｅｎｅＢｎＲＰＬｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｌｉｎｅＲ２（ｅａｓｙｔｏｄｉｓｐｅｒｓｅｓｅｅｄ）ｂｙＲＡＣＥａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｃｏｎｓ

6、ｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆＡｔＲＰＬｇｅｎｅＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｗｏＢｎＲＰＬｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｎａｍｅｄａｓＢｎＲＰＬａ［ｗｉｔｈａｎｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ１７５８ｂｐ，ｃｏｄｉｎｇ５８５ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ］ａｎｄＢｎＲＰＬｃ（ｗｉｔｈａｎＯＲＦｏｆ１７３４ｂｐ，ｃｏｄｉｎｇ５７７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）ＥａｃｈＢｎＲＰＬｓｉｎｃｌｕｄｅｄ３ｉｎｔｒｏｎｓａｎｄ４ｅｘｏｎｓＢｎＲＰＬ

7、ａａｎｄＢｎＲＰＬｃｗａｓ９２％ｉｄｅｎｔｉｃａｌＣｏｍｐａｒｉｎｇｔｏＲＰＬｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ，ＢｎＲＰＬｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔｏＡｔＲＰＬｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄＲＰＬｆｒｏｍＬｅｐｉｄｉｕｍｃａｍｐｅｓｔｒｅＶａｒｉａｔｉｏｎｏｆＲＰＬｐｒｏｔｅｉｎｏｃｃｕｒｒｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｆｒｏｍｄｉｃｏｔｓａｎｄｍｏｎｏｃｏｔｓＲＴ

8、－ＰＣＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｎＲＰＬｇｅｎｅｗａｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｉｌｉｑｕｅｓ（２０ｄａｆｔｅｒｂｌｏｏｍｉｎｇ）Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｉｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｍａｔｕｒｉｎｇｓｉｌｉｑｕｅｗａｌｌａｎｄｐｓｅｕｄｏｓｅｐｔｕｍ，ｂｕｔｎｏｔｉｎｓｅｅｄｓＫｅｙｗｏｒｄｓ：ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ；Ｓｉｌｉｑｕｅｗａｌｌ；Ｐｓｅｕｄｏｓｅｐｔｕｍ；ＲＰ

9、Ｌｇｅｎｅ；ＲＡＣＥ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎａｌｙｓｉｓ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ收稿日期：２０１２１００７基金項(xiàng)目：國(guó)家產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（ＣＡＲＳ－１３）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（２０１１ＢＡＤ１０Ａ１０４）；湖北省研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（２０１１－２０１５）作者簡(jiǎn)介：彭鵬飛（１９８４－），男，博士研究生，研究方向油菜分子育種通訊作者：梅德圣（１９７１－），男，副研究員，博士，從事油菜遺傳育種研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｓｈｅｎｇｍｅｉ＠ｈｏｔｍａｉｌ

10、ｃｏｍ角果開(kāi)裂在植物界廣泛存在，是繁衍的一種形式，對(duì)植物后代的繁殖和進(jìn)化具有重要意義，但角果開(kāi)裂卻給收獲籽實(shí)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了損失［１］。油菜的裂角是造成油菜減產(chǎn)的主要原因之一，也是目前實(shí)現(xiàn)機(jī)械化收獲急需解決的首要問(wèn)題。因此，提高油菜品種的抗裂角能力對(duì)于生產(chǎn)實(shí)際具有重要意義。當(dāng)前國(guó)內(nèi)油菜抗裂角研究較少，有限的研究主要集中在抗裂角種質(zhì)的篩選［２］和影響角果開(kāi)裂相關(guān)因素的分析上［３］。抗裂角性種質(zhì)資源的短缺嚴(yán)重制約著抗裂角性油菜品種的遺傳改良

11、，創(chuàng)造和培育抗裂角的新種質(zhì)非常重要。國(guó)內(nèi)外對(duì)模式植物擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）連接后克隆測(cè)序。１５甘藍(lán)型油菜ＢｎＲＰＬ的組織特異性表達(dá)分析在植株生長(zhǎng)期間，分別提取根、莖、葉、幼小花蕾和發(fā)育的角果（花后２０ｄ）以及花器官中的雄蕊和柱頭，即將成熟角果中的角果皮、種子與假隔膜的總ＲＮＡ，反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ后，采用Ｃｈａｉ等［１３］的半定量法檢測(cè)ＢｎＲＰＬ在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。以甘藍(lán)型油菜的看家基因Ａｃｔｉｎ（ＧｅｎＢａ

12、ｎｋ登錄號(hào)ＡＦ１１１８１２２）為內(nèi)參基因進(jìn)行半定量ＰＣＲ分析，采用的引物組合為ＲＰＬ－Ｆ－２２５（５’－ＣＧＡＴＴＣＣＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣ－３’）和ＲＰＬ－Ｒ－６５５（５’－ＧＡＡＴＧＧＡＴＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＴＧ－３’）、Ａｃｔｉｎ－Ｆ（５’－ＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣ－３’）和Ａｃｔｉｎ－Ｒ（５’－ＣＡＧＧＧＡＡＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＣＣＡＣＣ－３’）。１６ＢｎＲＰＬ基因全長(zhǎng)序列的ＰＣＲ擴(kuò)增為明

13、確甘藍(lán)型油菜ＢｎＲＰＬ基因結(jié)構(gòu)，參考擬南芥的ＡｔＲＰＬ基因組序列，分兩段擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜ＢｎＲＰＬ的基因組序列。以拼接得到的ＢｎＲＰＬａ基因ｃＤＮＡ序列分段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因組ＤＮＡ序列擴(kuò)增，引物分別為：ＲＰＬ－７０（５’－ＧＴＴＴＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＴ－３’）、ＲＰＬ－１２７８－Ｒ（５’－ＴＡＧＣＣＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＧＴＡ－３’）、ＲＰＬ－１２７８－Ｆ（５’－ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＴＧＧＣＴＡ－３’）

14、和ＲＰＬ－１８４４（５’－ＧＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＣＣＣＴＣＡＴＣ－３’）。以基因組ＤＮＡ為模板分段擴(kuò)增ＢｎＲＰＬ基因的全長(zhǎng)序列，反應(yīng)條件為：９５℃，３ｍｉｎ；９４℃，４５ｓ；５０℃，４５ｓ；７２℃，２ｍｉｎ；３４個(gè)循環(huán)；最后再７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物用１２％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收所得片段進(jìn)行克隆和測(cè)序。２結(jié)果與分析２１ＢｎＲＰＬ基因ｃＤＮＡ的克隆利用保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物在Ｒ２的ｃＤＮＡ中擴(kuò)增出了一條４８３ｂｐ的條帶（圖１Ａ）。該

15、條帶經(jīng)測(cè)序后提交ＧｅｎＢａｎｋ進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)克隆得到的核苷酸片段與擬南芥ＲＰＬ基因（ＡＴ５Ｇ０２０３０）１２１０－１６９２ｂｐ區(qū)段上的序列具有非常高的相似性，在Ｅ值為９ｅ－１４９的情況下，核苷酸序列的一致性達(dá)到８２％，表明此片段可能為甘藍(lán)型油菜ＲＰＬ基因的部分序列。根據(jù)ＰＣＲ擴(kuò)增得到的油菜ＲＰＬ基因片段序列，按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的ＳＭＡＲＴｅｒＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ說(shuō)明書(shū)的ＰＣＲ程序進(jìn)行５’ＲＡＣ

16、Ｅ和３’ＲＡＣＥ擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使用１２％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。結(jié)果顯示，３’ＲＡＣＥ擴(kuò)增出了比較單一的條帶，片段的大小為９００ｂｐ左右（圖１Ｂ），而５’ＲＡＣＥ擴(kuò)增出了兩條比較明顯的條帶，大小分別為１２００與１７００ｂｐ左右（圖１Ｂ）。每條ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行ｂｌａｓｔ比對(duì)。結(jié)果表明３’ＲＡＣＥ產(chǎn)物由兩類(lèi)同源性較高的序列組成，ＮＣＢＩ基因序列庫(kù)比對(duì)表明兩類(lèi)序列都屬于擬南芥ＡｔＲＰＬ（ＡＴ５Ｇ０２０３０）基因的同源序列。５’ＲＡＣ

17、Ｅ的兩個(gè)片段中，小片段序列與擬南芥的ＡｔＲＰＬ序列沒(méi)有同源性，屬于非特異性擴(kuò)增；長(zhǎng)片段屬于擬南芥ＡｔＲＰＬ的同源序列。由于５’ＲＡＣＥ與３’ＲＡＣＥ引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中有４９１ｂｐ的重疊序列，用ＣｏｎｔｉｇＡｓｓｅｍｂｌｙＰｒｏｇｒａｍ３（ＣＡＰ３）序列拼接軟件對(duì)５’ＲＡＣＥ序列和３’ＲＡＣＥ的兩類(lèi)序列進(jìn)行全長(zhǎng)拼接，得到了兩條長(zhǎng)度不同的全長(zhǎng)ｃＤＮＡ序列。其中一條序列長(zhǎng)度為２０６８ｂｐ，經(jīng)ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ軟件分析表明其開(kāi)放讀碼框（ＯＲＦ）序

18、列位置為１５４－１９１１位，總長(zhǎng)為１７５８ｂｐ，命名為ＢｎＲＰＬａ。另一條序列全長(zhǎng)為２０４１ｂｐ，ＯＲＦ序列位置為１５４－１８８７位，總長(zhǎng)為１７３４ｂｐ，命名為ＢｎＲＰＬｃ。序列比對(duì)表明ＢｎＲＰＬａ與ＢｎＲＰＬｃ具有較高的同源性，其ＯＲＦ序列的一致性達(dá)到９５％，主要變異集中在３’端。ＢｎＲＰＬａ和ＢｎＲＰＬｃ與擬南芥ＡｔＲＰＬ序列都具有較高的同源性，其ＯＲＦ序列的一致性分別為８４％和８５％。注：Ａ：保守區(qū)段擴(kuò)增；Ｂ：３’和５’ＲＡＣＥ結(jié)

19、果，Ｍ為分子量標(biāo)記，１為保守片段的ＰＣＲ結(jié)果，２為３’ＲＡＣＥ結(jié)果，３為５’ＲＡＣＥ結(jié)果Ｎｏｔｅ：Ａ，ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＰＬｇｅｎｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｆｒａｇｍｅｎｔ；Ｂ，ＰＣＲｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ３’－ＲＡＣＥａｎｄ５’－ＲＡＣＥ，Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ１：ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＰＬｇｅｎｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｆｒａｇｍｅｎｔ；Ｌａｎｅ２：ＰＣＲｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ３’－ＲＡＣＥ；Ｌａｎｅ３：ＰＣＲ

20、ｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ５’－ＲＡＣＥ圖１ＢｎＲＰＬ基因ｃＤＮＡ序列克?。疲椋纾保茫欤铮睿椋睿纾铮妫拢睿遥校蹋妫颍铮恚拢睿幔穑酰螅悖模危粒玻玻拢睿遥校痰男蛄蟹治雠c系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建ＢｎＲＰＬａ基因的全長(zhǎng)ｃＤＮＡ序列，經(jīng)ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ軟件分析表明其ＯＲＦ總長(zhǎng)為１７５８ｂｐ，編碼５８５個(gè)氨基酸，所編碼的蛋白質(zhì)理論分子量為６２８４ｋＤ，等電點(diǎn)為６８０。ＢｎＲＰＬｃ基因的ＯＲＦ序列長(zhǎng)度為１７３４ｂｐ，編碼５７７個(gè)氨基酸，理論分子量為６２１２ｋＤ