GPI-PLD基因表達(dá)水平對(duì)CML白血病細(xì)胞免疫清除的影響.pdf

1、研究背景：糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白質(zhì)是真核生物細(xì)胞質(zhì)膜上非常重要的一類(lèi)膜蛋白。GPI特異性磷脂酶D(GPI-PLD)能選擇性地水解GPI錨定蛋白質(zhì)中的肌醇磷酸酯鍵，釋放出錨定蛋白，影響GPI錨定蛋白質(zhì)的表達(dá)和生物學(xué)功能。該酶活性可受多種因素，包括脂多糖、氧化劑、葡萄糖和胰島素等的影響和調(diào)控。肝臟、胰腺和骨髓是人血漿GPI-PLD的重要來(lái)源。本課題組已經(jīng)從人骨髓基質(zhì)細(xì)胞中

2、克隆出GPI-PLD完整cDNA(長(zhǎng)度2．6kb，GenBank accession number AY007546)，這為進(jìn)一步研究GPI-PLD創(chuàng)造了條件。GPI錨定蛋白質(zhì)如CD55、CD59等是重要的免疫分子，T淋巴細(xì)胞的活化和增殖也涉及到富含GPI錨定蛋白、膽固醇、鞘糖脂、G蛋白和PTK的脂微區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。GPI錨定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)其發(fā)揮生理活性很重要，例如GPI錨定的CD55、CD59水解成可溶形式后，水溶性CD59的

3、功能就不完全，抑制補(bǔ)體的能力下降。慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是造血組織的一種惡性腫瘤，其白血病細(xì)胞BCR-ABL融合基因表達(dá)的產(chǎn)物屬src基因家族，具有PTK激酶活性。已經(jīng)有報(bào)道提示白血病細(xì)胞的某些GPI錨定蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能都可能存在異常。對(duì)一些白血病細(xì)胞株如K562、HL-60、U937等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，它們均可表達(dá)GPI-PLD，但其表達(dá)水平都非常低，而且不同細(xì)胞株表達(dá)的水平有差異。因此

4、，白血病細(xì)胞中GPI錨定蛋白和GPI-PLD水平變化與白血病的發(fā)生和發(fā)展可能有一定的聯(lián)系。為了研究CML患者GPI-PLD和GPI錨定CD55、CD59的表達(dá)水平以及它們之間的關(guān)系，GPI-PLD和GPI錨定蛋白質(zhì)在CML發(fā)病中可能的分子機(jī)制，白血病K562細(xì)胞株的GPI-PLD活性和表達(dá)水平是否會(huì)影響到免疫系統(tǒng)對(duì)它的殺傷作用，以及GPI-PLD與腫瘤免疫逃逸是否有密切聯(lián)系，研究者設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，初步探討和解決這些問(wèn)題。 方法:

5、 1．應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性定量RT-PCR技術(shù)確定正常人和CML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中GPI-PLD mRNA的表達(dá)水平，采用我室自制的具完整GPI結(jié)構(gòu)的胎盤(pán)型堿性磷酸酶(PLAP)作底物測(cè)定正常人和CML患者GPI-PLD的酶活性，流式細(xì)胞術(shù)分析外周血單個(gè)核細(xì)胞表面GPI錨定CD55和CD59的表達(dá)水平，Western-Blotting結(jié)合TX-114分相技術(shù)檢測(cè)GPI-PLD對(duì)GPI錨定CD55和CD59的釋放。 2．采用基因克隆

6、技術(shù)構(gòu)建GPI-PLD cDNA真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、過(guò)度表達(dá)GPI-PLD的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，通過(guò)檢測(cè)GPI-PLD mRNA的表達(dá)水平和酶活性以及對(duì)GPI錨定CD55和CD59的釋放，確定基因轉(zhuǎn)染是否成功。 3．用胰島素作為誘導(dǎo)劑分別對(duì)野生型K562細(xì)胞株和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPI-PLD基因陽(yáng)性克隆的K562細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，觀測(cè)GPI-PLDmRNA的表達(dá)水平、酶活性和GPI錨定CD55、CD

7、59的釋放變化。 4．臺(tái)盼藍(lán)排斥法觀測(cè)K562細(xì)胞GPI-PLD水平改變對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的殺傷率變化，MTT比色法判斷T淋巴細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞在不同GPI-PLD水平時(shí)的殺傷率。 結(jié)果: 1.檢測(cè)110名正常人和80例CML患者，發(fā)現(xiàn)CML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和血漿中GPI-PLD活性水平(均以釋放GPI錨定的PLAP的百分率表示)的平均值(x±s)為21.2±2.8％與28.9±3.6％，顯著性低于正常人

8、的水平(相應(yīng)為41.7±3.8％和41.9±4.5％)，其單個(gè)核細(xì)胞和血漿中酶活性水平減少的幅度分別為100％和70％(P<0.001)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CML患者單個(gè)核細(xì)胞GPI-PLD活性?xún)H為其血漿中酶活性水平的75％(P<0.001)，但正常人單個(gè)核細(xì)胞和血漿中GPI-PLD酶活性水平無(wú)顯著性差異(P<0.05). 2.競(jìng)爭(zhēng)性定量RT-PCR方法檢測(cè)20名正常人和20例CML患者的GPI-PLD mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果

9、表明，正常人和CML患者外周血單個(gè)核細(xì)胞GPI-PLD mRNA表達(dá)水平的平均值(x±s)相應(yīng)為1.237×10<'3>±42拷貝/ng 總RNA和0.438×10<'3>±30拷貝/ng總RNA，正常人GPI-PLD mRNA表達(dá)水平顯著性高于CML患者(P<0.001)，大約為其3倍。其中6例CML患者經(jīng)骨髓移植治療成功后，GPI-PLD活性和mRNA表達(dá)水平均基本恢復(fù)至正常人的水平。 3.流式細(xì)胞術(shù)分析20名正常人和40例

10、CML患者，發(fā)現(xiàn)其外周血單個(gè)核細(xì)胞GPI錨定CD55和CD59分子均顯示陽(yáng)性，但其熒光強(qiáng)度的數(shù)值范圍正常人較CML患者要彌散一些。正常人CD55和CD59分子的熒光強(qiáng)度值范圍相應(yīng)在330.7至673.8和545.6到782.4；CML患者其數(shù)值范圍相應(yīng)在438.8至478.6和641.2到704.6；CML患者單個(gè)核細(xì)胞表面CD55和CD59表達(dá)水平的平均值(x±s)相應(yīng)為537.2±25與747.9±35，正常人相應(yīng)為458.0±13

11、與677.4±19，CML患者這兩種分子的表達(dá)水平都顯著性高于正常人(P<0.05)。 4.成功構(gòu)建了GPI-PLD cDNA的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/GPI-PLD，篩選到了穩(wěn)定高表達(dá)GPI-PLD活性的K562細(xì)胞株。陽(yáng)性克隆細(xì)胞株的GPI-PLD活性和mRNA表達(dá)水平比陰性包括空載體陽(yáng)性對(duì)照組K562細(xì)胞都相應(yīng)提高了約6和7倍，功能鑒定還顯示陽(yáng)性克隆細(xì)胞表面的GPI錨定CD55和CD59分子數(shù)量均顯著性減少

12、，僅為對(duì)照組的一半。 5.用10<'-7>mol/L濃度的胰島素誘導(dǎo)野生型K562細(xì)胞株24h和48h，可導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞的GPI-PLD mRNA表達(dá)水平和GPI-PLD活性水平同步增高4倍和7倍；誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染型K562細(xì)胞株24h和48h，可使它們?cè)谠懈弑磉_(dá)水平上再增高約10％和20％。 6.Western-Blotting結(jié)合TX-114分相技術(shù)檢測(cè)野生型K562細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染型K562細(xì)胞，經(jīng)胰島素誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)其細(xì)

13、胞內(nèi)的GPI-PLD活性水平不同，保留在細(xì)胞膜上的GPI錨定型CD55和CD59的量，以及出現(xiàn)于細(xì)胞培養(yǎng)液中的水溶性CD55和CD59的量也不同，這證明釋放反應(yīng)由GPI-PLD催化實(shí)現(xiàn)。 7.胰島素誘導(dǎo)24 h和48 h后，野生型K562細(xì)胞的補(bǔ)體殺傷率由誘導(dǎo)前的6.44±0.22％顯著性增高到12.19±0.14％和18.79±0.4296，增高的百分率分別為189％和293％；陽(yáng)性克隆K562細(xì)胞經(jīng)胰島素誘導(dǎo)24h和48h后

14、，其補(bǔ)體殺傷率也在原有高殺傷率(18.40±0.41％)基礎(chǔ)上顯著性增高到20.87±0.70％和25.28±0.26％，增高的百分率分別為112％和137％。而且，GPI-PLD酶活性與補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺傷率成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.975。 8.胰島素誘導(dǎo)24 h和48 h后，野生型K562細(xì)胞被T淋巴細(xì)胞的殺傷率由誘導(dǎo)前的8.45±0.32％顯著性增高到26.77±0.37％和32.70±0.43％，增高的百分率分別為316

15、％和507％；陽(yáng)性克隆K562細(xì)胞經(jīng)胰島素誘導(dǎo)24h和48h后，其T淋巴細(xì)胞殺傷率也在原有高殺傷率(36.81±0.31％)基礎(chǔ)上顯著性增高到43.72±0.12％和49.30±0.28％，增高的百分率分別為119％和133％。GPI-PLD酶活性與T淋巴細(xì)胞的殺傷率也成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.959。 結(jié)論： 1.首次報(bào)道CML患者白血病細(xì)胞GPI-PLD活性和表達(dá)水平比正常人顯著性減少，經(jīng)骨髓移植治療成功后，兩者可恢復(fù)

16、至正常人的水平；白血病細(xì)胞膜上GPI-PLD活性低下可導(dǎo)致細(xì)胞表面GPI錨定CD55和CD59的數(shù)目顯著性增加。 2.首次成功建立穩(wěn)定高表達(dá)GPI-PLD cDNA的白血病K562細(xì)胞株。 3.發(fā)現(xiàn)胰島素誘導(dǎo)K562細(xì)胞株可導(dǎo)致GPI-PLD基因過(guò)度表達(dá)及GPI-PLD活性顯著性增加，與此同時(shí)，細(xì)胞表面GPI錨定CD55和CD59的分子數(shù)量均顯著性減少，細(xì)胞被補(bǔ)體和T淋巴細(xì)胞的殺傷率都相應(yīng)增加。 4.首次闡述和證