新的白血病相關(guān)基因CML28的功能研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究新的腫瘤相關(guān)抗原CML28在白血病細(xì)胞系及原代白血病細(xì)胞中表達(dá)；
　　 2.構(gòu)建負(fù)載CML28腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞免疫應(yīng)答疫苗，誘導(dǎo)特異性針對(duì)CML28抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答；靶向沉默SOCS1基因在樹突狀細(xì)胞(DC)中的表達(dá)，增強(qiáng)CML28樹突狀細(xì)胞疫苗的免疫應(yīng)答功能；
　　 3.靶向沉默CML28/hRrp46p在人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞中的表達(dá)，研究CML28基因表達(dá)與K562細(xì)

2、胞凋亡與增殖的關(guān)系，探討hRrp46p/exosome在K562細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　 方法：
　　 1.采用Trizol一步法抽提白血病細(xì)胞系以及原代白血病細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)針對(duì)CML28的PCR引物CML28-5P CML28-3P，經(jīng)序列同源性分析，采用RT-PCR檢測(cè)、研究CML28 mRNA在白血病細(xì)胞的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參照。
　　 2

3、.設(shè)計(jì)針對(duì)CML28基因的特異性克隆引物CML28-5P1CML28-3P1，經(jīng)BLAST分析，采用RT-PCR從K562細(xì)胞中擴(kuò)增出CML28的cDNA全長(zhǎng)；采用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物以及真核表達(dá)載體pcDNA3.1 HisA后，將酶切后的PCR產(chǎn)物定向克隆至pcDNA3.1 HisA獲得重組載體pcDNA3.1 His-CML28，氨芐青霉素篩選酶切測(cè)序鑒定；采用RT-PCR方法CML28-5P2 CML28-3P2，

4、將His-CML28融合蛋白的編碼序列定向克隆至IRES雙表達(dá)載體pIRES2-EGFP獲得重組載體pHis-CML28-IRES2-EGFP，卡那霉素篩選陽性克隆，酶切測(cè)序鑒定，DH5α擴(kuò)增純化重組質(zhì)粒；從健康供體外周血中通過密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化培養(yǎng)獲得DC；采用電穿孔方法將pHis-CML28-IRES2-EGFP導(dǎo)入到DC中，以RT-PCR、Western Blotting以及熒光顯微鏡分別檢測(cè)C

5、ML28 mRNA、His-CML28融合蛋白、GFP的表達(dá)，并評(píng)估轉(zhuǎn)染效率；以CFSE標(biāo)記未貼壁的同種PBMCs，與轉(zhuǎn)染后的DC進(jìn)行混和淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)分析同種反應(yīng)淋巴細(xì)胞的增殖情況，分別選擇不同的白血病細(xì)胞系、轉(zhuǎn)染前后的DC、同種PBMCs以及原代白血病細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以不同的效靶比(E：T)進(jìn)行CTL細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。利用載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，采用siRNA Wizard設(shè)計(jì)靶向SOCS1基因的小分子干

6、擾RNA(siRNA)序列，經(jīng)BLAST分析，構(gòu)建靶向沉默SOCS1基因的siRNA表達(dá)載體psiRNA-SOCS1；采用電穿孔技術(shù)將CML28重組表達(dá)載體pHis-CML28-IRES2-EGFP和SOCS1干擾載體psiRNA-SOCS1共轉(zhuǎn)染至DC中，采用RT-PCR研究檢測(cè)siRNA對(duì)于SOCS1基因的干擾效率；對(duì)照比較干擾SOCS1表達(dá)前后，CFSE-MLR中DC對(duì)于同種反應(yīng)淋巴細(xì)胞的刺激增殖能力以及效應(yīng)細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)于靶細(xì)

7、胞殺傷效應(yīng)的影響，評(píng)價(jià)沉默SOCS1基因?qū)τ贑ML28樹突狀細(xì)胞疫苗的增敏效應(yīng)。
　　 3.利用siRNA Wizard設(shè)計(jì)靶向針對(duì)CML28/hRrp46p的siRNA靶序列，經(jīng)BLAST分析后，設(shè)計(jì)相應(yīng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)及BbsⅠ粘性末端。
　　 siRNA1:Oligo 1：TCC C AA CAC GTC TTC CGT TTC TA T CAA GAG TAG AAA CGG AAG ACG TGT T TT
　　

8、 Oligo 2:CAA AAA AAC AGG TCT TCC GTT TCT A CT CTT GA T AGA AAC GGA AGA CGT GTT；
　　 siRNA2:
　　 Oligo1：TCCC AACA CGTC TTCC GTTT CTACC TTCAAGAGA GGTAG AAAC GGAA GA CC TGTT TT
　　 Oligo2：CAAAA AACA CGTC TTCC GTTT

9、 CTACC TCTCTTGAA GGTAG AAAC GGAA GA CC TGTT；
　　 siRNA 3:
　　 Oligo 1：TCCC AATC GCTG CAGA GGCGTTACT TTCAAGAGA AGT AACGCC TCTGCAGCGATT TT
　　 Oligo 2：CAAAA AATC GCTG CAGA GGCGTTACT TCTCTTGAA AGT AACGCC TCTGCAGCGA

10、TT；
　　 采用DNA連接酶將退火聚合后的siRNA連接到siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白篩選獲得陽性克隆并測(cè)序鑒定，獲得CML28 特異性siRNA表達(dá)載體psiRNA-CML28；通過電穿孔導(dǎo)入到K562細(xì)胞中，采用RT-PCR(RT primer:5’-AGCC CAAT CTTC G-3’；CML28 PCR Primer：5’-GCTG CCAG GCGG AAGT GA-3’，5’-CTGT TC

11、GC AGGC AAAG TG-3’)
　　 篩選評(píng)價(jià)3個(gè)干擾載體對(duì)于CML28的基因沉默效率；采用CFSE標(biāo)記K562細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測(cè)沉默CML28表達(dá)后K562細(xì)胞的增殖變化情況；采用Annexin-V/PI雙染K562細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測(cè)CML28沉默后對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.CML28 mRNA在白血病細(xì)胞系以及原代白血病細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)，在急性髓系白血病細(xì)胞，加速期和急

12、變期的慢性髓系白血病細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞和慢性髓系白血病慢性期細(xì)胞中低水平表達(dá)。
　　 2.RT-PCR成功從K562細(xì)胞中擴(kuò)增出CML28 cDNA全長(zhǎng)，重組載體pcDNA3.1 His-CML28和pHis-CML28-IRES2-EGFP經(jīng)酶切及DNA測(cè)序鑒定，含有正確的CML28編碼序列；經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，PBMCs能成功培養(yǎng)出具有典型形態(tài)特征以及免疫表型特征的DC；經(jīng)電穿孔導(dǎo)入重組質(zhì)粒pH

13、is-CML28-IRES2-EGFP后，RT-PCR、Western Blotting分別證實(shí)CML28 mRNA以及His-CML28融合蛋白在DC中的表達(dá)，熒光倒置顯微鏡檢測(cè)到GFP蛋白的表達(dá)；不同效靶比進(jìn)行CFSE-MLR的FACS分析顯示，同種反應(yīng)淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的增殖反應(yīng)；CTL細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MLR獲得的效應(yīng)細(xì)胞能特異性殺傷MHC限制性相合的CML28陽性的靶細(xì)胞；RT-PCR檢測(cè)顯示，經(jīng)電穿孔導(dǎo)入psiRNA-S

14、OCS1重組質(zhì)粒后，SOCS1 mRNA在DC細(xì)胞中表達(dá)水平呈現(xiàn)出與轉(zhuǎn)染效率相關(guān)的不同程度下調(diào)；FACS檢測(cè)CFSE-MLR結(jié)果顯示，SOCS1表達(dá)下調(diào)后，同種反應(yīng)細(xì)胞的增殖反應(yīng)呈現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)；CTL殺傷實(shí)驗(yàn)顯示，SOCS1基因表達(dá)下調(diào)增加了效應(yīng)細(xì)胞對(duì)于MHC相合CML28陽性靶細(xì)胞的殺傷活性。
　　 3.藍(lán)白篩選的陽性克隆經(jīng)測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒psiRNA-CML28分別含有3個(gè)正確的siRNA靶序列；經(jīng)優(yōu)化電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染條件，經(jīng)

15、電穿孔導(dǎo)入到K562細(xì)胞后，RT-PCR檢測(cè)siRNA3導(dǎo)入后，CML28 mRNA水平被明顯下調(diào)；Annexin-V/PI雙染FACS檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡顯示CML28表達(dá)被下調(diào)后K562細(xì)胞凋亡增加；CFSE標(biāo)記的FACS檢測(cè)增殖實(shí)驗(yàn)顯示，CML28表達(dá)下調(diào)后，K562細(xì)胞增殖活性減低。
　　 結(jié)論：
　　 1.CML28 mRNA在急性髓系白血病，加速期、急變期慢性髓系白血病細(xì)胞中均呈現(xiàn)高水平表達(dá)，在急性淋巴細(xì)胞白

16、血病以及慢性期慢性髓系白血病細(xì)胞中低水平表達(dá)，是新的白血病相關(guān)抗原，從這個(gè)意義上，成功誘導(dǎo)CML28特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答將為白血病的過繼免疫治療提供全新的靶點(diǎn)。
　　 2.利用供體PBMCs成功培養(yǎng)出具有典型形態(tài)特征以及免疫表型特征的DC；CML28 樹突狀細(xì)胞核酸疫苗能誘導(dǎo)出針對(duì)CML28陽性靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答；siRNA介導(dǎo)的RNAi促進(jìn)了DC免疫表型向成熟DC轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)了DC的刺激增殖能力，沉默SOCS1基因能有效

17、增強(qiáng)CML28樹突狀細(xì)胞核酸疫苗的殺傷效應(yīng)。
　　 3.siRNA下調(diào)CML28 mRNA在K562細(xì)胞中的表達(dá)，抑制了K562細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了其凋亡，提示CML28/hRrp46p不僅僅是一個(gè)腫瘤標(biāo)志物，更與腫瘤的增殖和凋亡有著重要的聯(lián)系；結(jié)合(1)期工作的研究，CML28/hRrp46p作為exosome的一個(gè)亞單位，其在白血病細(xì)胞中高表達(dá)，可能提示exosome在血液腫瘤中的功能亢進(jìn)狀態(tài)，exosome可能與腫瘤的增殖和