白血病與非白血病骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)HL-60細(xì)胞影響的比較研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是繼造血干細(xì)胞之后發(fā)現(xiàn)的另一類(lèi)骨髓成體干細(xì)胞，具有重要的造血調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)作用。對(duì)正常的造血干細(xì)胞(HSC)和白血病細(xì)胞都產(chǎn)生影響。 目的： 1.探討非白血病MSC對(duì)人類(lèi)急性髓性白血病(AML)細(xì)胞系HL-60細(xì)胞增殖分化的影響以及相關(guān)分子機(jī)制。 2.比較急性髓性白血病MSC，急性髓性白血病完全緩解后MSC以及非白血病MSC的部分生物學(xué)特性。 3.比較急性髓性白血病MSC，急性髓

2、性白血病完全緩解后MSC以及非白血病MSC對(duì)HL-60細(xì)胞影響。 方法： 第一部分 1.應(yīng)用密度梯度離心法從非白血病骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)一步貼壁培養(yǎng)分離：MSC。建立MSC細(xì)胞層后，直接將HL-60細(xì)胞種植于MSC細(xì)胞層上，兩者共培養(yǎng)。 2.應(yīng)用直接計(jì)數(shù)法，在不同時(shí)間計(jì)數(shù)單獨(dú)培養(yǎng)的和與MSC共培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞，描繪其時(shí)間-數(shù)量曲線。 3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與MSC共培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞和單

3、獨(dú)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞的細(xì)胞周期以及凋亡的細(xì)胞比例。 4.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與MSC共培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞和單獨(dú)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞的CD11b與CD14的表達(dá)。 5.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與MSC共培養(yǎng)HL-60細(xì)胞和單獨(dú)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞Survivin蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)。 6.瑞氏染色后光鏡下觀察與MSC共培養(yǎng)后的HL-60細(xì)胞，并計(jì)算分化率，以單獨(dú)培養(yǎng)的HL-60為對(duì)照。 7.吞墨實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與

4、MSC共培養(yǎng)后的HL-60細(xì)胞的功能。 第二部分 1.原位瑞氏染色觀察急性髓性白血病MSC，急性髓性白血病完全緩解MSC以及非白血?。篗SC的細(xì)胞形態(tài)。 2.原位瑞氏染色后計(jì)數(shù)CFU-F的個(gè)數(shù)。 3.計(jì)數(shù)從種植單個(gè)核細(xì)胞到MSC細(xì)胞融合的時(shí)間。 4.采用直接計(jì)數(shù)法，在不同時(shí)間計(jì)數(shù)以上各組MSC的數(shù)量，并描繪其時(shí)間-數(shù)量曲線。 5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組MSC的免疫表型和細(xì)胞周期并計(jì)算DI值。

5、 6.采用直接計(jì)數(shù)法，在不同時(shí)間計(jì)數(shù)與各組MSC共培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞并比較。 7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)與各組MSC共培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞的CD11b和Survivin蛋白表達(dá)，以及細(xì)胞周期分布并比較。 8.瑞氏染色后光鏡下觀察與各組MSC共培養(yǎng)后的HL-60細(xì)胞形態(tài)，計(jì)算分化率并比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用STATA統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組變量記錄為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差。非白血病MSC共培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞與單獨(dú)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞

6、之間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，與不同組MSC共培養(yǎng)后HL-60細(xì)胞之間的數(shù)據(jù)比較采用方差分析。各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性評(píng)估采用簡(jiǎn)單線性回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 第一部分 1.非白血病MSC與HL-60細(xì)胞共培養(yǎng)后，HL-60細(xì)胞的增殖明顯受抑，這種作用在5-7天顯著(第3天比較P=0.07，第5天比較P=0.01，第7天比較P<0.01) 2.細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與MSC共培養(yǎng)后HL-60細(xì)

7、胞分布于G0/G1期比例明顯增加(對(duì)照組為47.0±9.0％，實(shí)驗(yàn)組為70.0±16.0％，P=0.003)。并且在G0/G1期左側(cè)出現(xiàn)凋亡峰。 3.HL-60細(xì)胞的Survivin蛋白和Bcl-2 蛋白表達(dá)，在與MSC共培養(yǎng)后同時(shí)下調(diào)(Bcl-2：對(duì)照組為63.0±9.1％，實(shí)驗(yàn)組為50.0±14.1％，P=0.045；Survivin：對(duì)照組為94.0±9.3％，實(shí)驗(yàn)組為77.0±11.8％，P=0.006)。 4.

8、HL-60細(xì)胞的CD11b和CD14表達(dá)在與MSC共培養(yǎng)后顯著升高(對(duì)照組為陰性，實(shí)驗(yàn)組為25.0±3.2％) 5.HL-60細(xì)胞經(jīng)過(guò)Survivin與CD11b單克隆抗體雙標(biāo)后，發(fā)現(xiàn)一群CD11b陽(yáng)性細(xì)胞，Survivin陰性表達(dá)的細(xì)胞，比例在16.04±4.9％。 6.形態(tài)學(xué)分析，有部分細(xì)胞向中晚幼細(xì)胞以及單核細(xì)胞分化，分化率為18.0±9.0％。 7.與MSC共培養(yǎng)處理后的HL-60細(xì)胞吞墨實(shí)驗(yàn)陰性。

9、 第二部分 1.第14天CFU-F 個(gè)數(shù)為：白血病組為20.04±2.1個(gè)/10<'7>MNC，非白血病組為25.04±3.0個(gè)/10<'7>MNC，CR 白血病組為 23.0±4.1個(gè)/10<'7>MNC。白血病組MSC的最少，三組比較差異顯著，P=0.01，其他兩組比較差異不顯著，P>0.05。 2.各組MSC的融合時(shí)間：白血病組為26.0±3.0天，非白血病組為21.0±1.0天，CR白血病組為22.0±2.0天

10、。白血病組融合時(shí)間最長(zhǎng)，三組比較差異顯著(P<0.01)。 3.經(jīng)過(guò)篩選傳代后的各組MSC增殖狀態(tài)無(wú)差異。在第3、5、7天對(duì)各組進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，P值均大于0.05，無(wú)差異。 4.各組MSC的細(xì)胞形態(tài)在光鏡水平下無(wú)差異。 5.各組MSC的CD105、CD106均為高表達(dá)，CD45表達(dá)陰性，各組的CD105和CD106表達(dá)比較，P值分別為0.37、0.50，無(wú)差異。 各組MSC的G0/G1期細(xì)胞比例為：白血

11、病組為89.94±4.0％，非白血病組為90.2±3.0％，CR白血病組為91.0±3.0％，三組比較無(wú)差異(P=0.79)。 各組MSC的DI值都在0.9-1.1范圍之內(nèi)。 6.與各組MSC共培養(yǎng)后，HL-60的細(xì)胞計(jì)數(shù)：在第5天和第7天對(duì)各組比較無(wú)差異，P值分別為：0.77、0.96。 7.與各組MSC共培養(yǎng)后，HL-60細(xì)胞周期分布、Survivin表達(dá)和CD11b表達(dá)比較無(wú)差異，P值分別為：0.89、0.

12、08、0.19。 8.HL-60細(xì)胞與各組MSC共培養(yǎng)后，細(xì)胞的形態(tài)皆向成熟方向轉(zhuǎn)化，分化率分別為18.0±3、117.0±1.3、19.0±2.0，比較無(wú)差異(P=0.23)。 結(jié)論： 第一部分 1.骨髓MSC對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖有抑制作用： ①可能通過(guò)阻止細(xì)胞進(jìn)入周期循環(huán)或者延緩周期進(jìn)展速度來(lái)實(shí)現(xiàn)。 ②可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的分化，使細(xì)胞退出增殖周期。 ③這種抑制作用通過(guò)MSC分泌

13、的細(xì)胞因子和與HL-60細(xì)胞的直接接觸實(shí)現(xiàn)的。 2.骨髓MSC可以引起HL-60細(xì)胞的凋亡，凋亡是伴隨于分化的，與分化密切相關(guān)。細(xì)胞的凋亡伴隨Bcl-2和Survivin的同時(shí)下調(diào)，推測(cè)兩種凋亡相關(guān)蛋白有相關(guān)性。 3.骨髓MSC對(duì)HL-60細(xì)胞有促進(jìn)分化的作用，但是不能完成終端分化。 4.骨髓MSC對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制和促分化作用，對(duì)于開(kāi)辟白血病治療新思路起到一定的作用。但MSC對(duì)HL-60的周期阻滯可能會(huì)