煙草細(xì)胞與發(fā)狀根培養(yǎng)體系的建立及輔酶Q-,10-生物合成研究.pdf

1、本試驗(yàn)以煙草品種中煙98、中煙99、中煙100、心葉煙、NC89、K326等為試材，開(kāi)展了以煙草細(xì)胞懸浮和發(fā)狀根培養(yǎng)技術(shù)為手段，以生物轉(zhuǎn)化方式生產(chǎn)輔酶Q<,10>為最終目的的實(shí)驗(yàn)室研究，以期為今后應(yīng)用煙草植物細(xì)胞和發(fā)狀根培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)輔酶Q<,10>提供理論依據(jù)。 1.本試驗(yàn)研究了6個(gè)煙草品種(中煙98、中煙99、中煙100、心葉煙、NC89、K326)的葉片和根系的輔酶Q<,10>含量。結(jié)果表明：在煙草幼苗葉片中，以中煙9

2、8輔酶Q。。含量最高，NC89次之，心葉煙最低；在煙草幼苗根系中，以中煙99輔酶Q<,10>含量最高，NC89和心葉煙次之，K326最低；中煙99、中煙100、K326、NC89、心葉煙等5個(gè)品種的根系輔酶Q<,10>含量均明顯高于其葉片中輔酶Q<,10>的含量。 2.進(jìn)行了煙草輔酶Q<,10>分離、提取方法的優(yōu)化和比較。乙醇浸提法中，乙醇濃度90％、料液比1：20，回流溫度70℃、回流時(shí)間120 min為最佳提取方法；丙酮研磨

3、法中，料液比1：3、正己烷萃取的效果最佳；堿皂化法的最佳提取條件為：酸消解pH值為3，料液比為1：10，80℃回流90min時(shí)，堿皂化處理pH為11，料液比1：15，回流溫度100℃，回流時(shí)間：30min時(shí)，輔酶Q<,10>含量最高。丙酮研磨正己烷萃取法工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，提取效率高，適合輔酶Q<,10>含量的初步測(cè)定。 3.以輔酶Q<,10>含量較高的NC89煙草品種為試材，采用煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)影響煙草細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,1

4、0>形成的最佳理化條件進(jìn)行了選擇與優(yōu)化。 (1)通過(guò)改變激素配比和培養(yǎng)條件等策略，獲得了適合液體懸浮培養(yǎng)的愈傷組織。其中，加入激素NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基比加入激素2，4-D和KT的MS培養(yǎng)基更適合誘導(dǎo)煙草愈傷組織的產(chǎn)生；最適繼代培養(yǎng)基為MS+NAA 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+3％蔗糖+0.7％瓊脂；光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)更適合煙草愈傷的繼代培養(yǎng)。 (2)建立了快速生長(zhǎng)的煙草細(xì)胞系，通過(guò)篩選溫度、接種量及激

5、素配比等優(yōu)化了懸浮培養(yǎng)條件。25℃是適合煙草細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,10>合成的溫度；細(xì)胞最適接種量為3～4g；最適液態(tài)培養(yǎng)基激素配比為NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.8 mg/L。蔗糖濃度和pH值會(huì)影響煙草細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,10>形成。蔗糖濃度為3％左右時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)快，細(xì)胞生物量大，有利于輔酶Q<,10>積累，輔酶Q<,10>總量高；pH值為5.8～6.4.時(shí)適于煙草細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,10>合成。 (3)比較了幾種植物生

6、長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)煙草細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,10>含量的影響。其中，低濃度IAA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,10>含量均無(wú)明顯影響，但I(xiàn)AA濃度大于2.0 mg/L時(shí)，會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,10>形成；2，4-D使細(xì)胞生物量有一定程度的降低，但卻能提高輔酶Q<,10>含量，其中2，4-D濃度為0.5 mg/L，輔酶Q<,10>總量高達(dá)7.639 mg/L，與對(duì)照相比提高了24.27％；KT濃度為0.5 mg/L時(shí)，可提高細(xì)胞生物量，但輔酶Q<,10

7、>總量變化不明顯，KT濃度大于2.0 mg/L時(shí)，則對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，輔酶Q<,10>含量有所下降。 (4)研究了幾種有機(jī)物質(zhì)和前體物質(zhì)對(duì)煙草細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,10>形成的影響。鹽酸硫胺素濃度為4.0 mg/L時(shí)，細(xì)胞干重、輔酶Q<,10>含量及總量最高，分別為23.873g/L、343 μg/g、和8.176 mg/L；L-苯丙氨酸為2.0 mg/L時(shí)，對(duì)煙草細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，但對(duì)輔酶Q<,10>形成有一定的促進(jìn)作用，最大

8、增幅為22.13％；對(duì)羥基苯甲酸濃度低于5.0mg/L時(shí)，對(duì)煙草細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但可促進(jìn)輔酶Q<,10>的形成，最大增幅達(dá)19.85％；添加L-酪氨酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和輔酶Q<,10>的形成作用不明顯。 (5)研究了生長(zhǎng)素IAA與幾種營(yíng)養(yǎng)和前體物質(zhì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)輔酶Q<,10>合成的影響。最適營(yíng)養(yǎng)條件為IAAO.5mg/L+鹽酸硫胺素4.0mg/L+L-苯丙氨酸1.0mg/L+對(duì)羥基苯甲酸5.0mg/L和IAA0.5mg/L+鹽酸硫胺

9、素4.0mg/L+L-苯丙氨酸2.0mg/L+對(duì)羥基苯甲酸2.0mg/L。 4.利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌株在煙草外植體上直接誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)根，在MS固體培養(yǎng)基上建立起發(fā)根離體培養(yǎng)系；通過(guò)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察判斷法和PCR法檢測(cè)煙草發(fā)狀根中發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒致根基因的轉(zhuǎn)化情況；并就懸浮培養(yǎng)中有利于發(fā)狀根生長(zhǎng)及輔酶Q<,10>合成的影響因子進(jìn)行了初步的研究。 (1)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草形成發(fā)狀根的效率，受發(fā)根農(nóng)桿菌種類、濃度、及

10、煙草品種、葉片發(fā)育時(shí)期、葉片在菌液中浸泡時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間及外源加入不同生長(zhǎng)激素等多種因素的影響。采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ATCC15834：菌株感染中煙99無(wú)菌苗幼嫩葉圓片5min，在pH值5.8的添加0.1mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d，可達(dá)最大轉(zhuǎn)化效率69.35％。 (2)通過(guò)發(fā)狀根形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)狀根沒(méi)有分化出典型的根冠結(jié)構(gòu)；PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rol B基因560bp的特異性DNA片段已在煙草

11、發(fā)根基因組中整合并得到表達(dá)。 (3)在MS固體培養(yǎng)基上建立起發(fā)根離體培養(yǎng)系，經(jīng)連續(xù)多代的培養(yǎng)，發(fā)根仍保持旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)。懸浮培養(yǎng)中煙草發(fā)狀根的生長(zhǎng)及輔酶Q<,10>合成受到基本培養(yǎng)基類型、初始pH值、蔗糖濃度、裝液量及激素種類和濃度等因素的影響。1/2 MS培養(yǎng)基，蔗糖20～30g/，DH 6.4，裝液量為40mL/100mL是適合煙草發(fā)狀根液體培養(yǎng)的條件；適當(dāng)濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有利于促進(jìn)發(fā)狀根生長(zhǎng)，增加輔酶Q<,10>積累量，