熱帶假絲酵母輔酶Q-,10-高產(chǎn)菌的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化研究.pdf

1、輔酶Q<,10>，一類脂溶性醌類化合物，以極低的含量廣泛存在于動物、植物、微生物等細胞內(nèi)。作為呼吸鏈中的遞氫體，在生物體中具有重要的生理功能，是細胞內(nèi)天然抗氧化劑，細胞代謝的激活劑，并能夠提高機體免疫力，在臨床中有著廣泛的用途。本文以熱帶假絲酵母AS 2.1387為出發(fā)菌株，對輔酶Q<,10>高產(chǎn)菌進行了誘變選育，并對其發(fā)酵條件，提取工藝進行了各方面的優(yōu)化，大幅度提高了輔酶Q<,10>的發(fā)酵單位，主要研究結(jié)果有以下幾個方面： 1

2、．研究了紫外線、硫酸二乙酯單因子，以及復(fù)合因子對出發(fā)菌株的誘變效應(yīng)，硫酸二乙酯一紫外復(fù)合誘變是抗性高產(chǎn)菌育種的最佳誘變方式，其最適劑量為1％的DES處理40min，再經(jīng)紫外處理60s，致死率與突變率分別為91.5％與2.71％；在營養(yǎng)缺陷型突變菌的選育中，硫酸二乙酯單因子誘變?yōu)樽罴训恼T變方式，最適劑量為1％的DES處理40min，突變率達到2.3％。通過放線菌素D對突變菌進行廣譜抗性初篩，并以高濃度前體物質(zhì)對羥基苯甲酸以及終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似

3、物維生素K<,3>進行特異性篩選，最終選育得到了一株遺傳穩(wěn)定性良好的輔酶Q<,10>高產(chǎn)突變株APV.12，其發(fā)酵產(chǎn)量達到了23.958mg/L，比出發(fā)菌株提高了1.76倍。 2．本課題對輔酶Q<,10>高產(chǎn)突變株APV.12進行了一系列的發(fā)酵工藝優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖3.5％、酵母膏0.6％、蛋白胨0.4％、(NH<,4>)<,2>SO<,4> 0.1％、玉米粉0.1％、MgSO<,4>-7H<,2>O0.05

4、％、K<,2>HPO<,4>0.05％、KH<,2>PO<,4>0.1％、CaCl<,2>0.1％、NaAc0.2％。研究了對羥基苯甲酸、胡蘿卜汁、番茄汁三種添加物質(zhì)對熱帶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q<,10>的具體影響，并確定了其最適添加量，各因素的最佳組合為：PHB：0.15％，胡蘿卜汁：0.6％，番茄汁：0.4％。 3．通過發(fā)酵工藝優(yōu)化，得出輔酶Q<,10>高產(chǎn)突變株APV.12最佳發(fā)酵條件為：溫度30℃，pH6.0，接種量6％

5、，250ml錐形瓶中裝液量60ml，發(fā)酵時間48h。優(yōu)化后的菌體生物量和輔酶Q<,10>發(fā)酵單位均高于優(yōu)化前，輔酶Q<,10>發(fā)酵單位達到了28.102mg/L，比優(yōu)化前提高了17.3％；APV.12菌株的發(fā)酵單位最終比出發(fā)菌株AS 2.1387提高了2.24倍。 4．對輔酶Q<,10>的提取純化工藝進行了各方面的優(yōu)化，最適提取條件為：濃度2mol/L的氫氧化鈉溶液破壁并皂化，皂化溫度90℃，回流時間為60min，石油醚萃取后的

6、皂化液中的菌體殘渣用丙酮進行再處理；提取工藝優(yōu)化后輔酶Q<,10>的得率較優(yōu)化前提高了58.9％；粗提液經(jīng)硅膠柱層析純化后，雜質(zhì)含量減少，純化樣品中輔酶Q<,10>的含量達到98.16％。 5．對輔酶Q<,10>的檢測進行了研究，比較了UV法、TLC-UV法與HPLC法三種檢測方法的相關(guān)性，并對其檢測結(jié)果進行了驗證，確定以UV法作為育種與發(fā)酵優(yōu)化實驗中的快速檢測方法，可以采用TLC-UV法進行定量分析，其檢測結(jié)果與HPLC法相差