HBV YMDD變異檢測方法的建立及臨床應(yīng)用的初步研究.pdf

1、目的拉米夫定是近年用于抗HBV的主要藥物之一，它可明顯抑制HBV的復(fù)制，進而達(dá)到控制炎癥、穩(wěn)定病情甚至阻止肝纖維化的進展，但抑制病毒復(fù)制作用短暫，易于復(fù)發(fā)。隨著用藥時間的延長，在藥物和人體免疫選擇壓力下可產(chǎn)生耐藥。YMDD是拉米夫定抗HBV治療最常出現(xiàn)變異的區(qū)域，一旦出現(xiàn)YMDD變異株，可能會伴有HBVDNA水平反跳和肝功能變化，甚至導(dǎo)致病情惡化。故開展YMDD變異的檢測很有必要，對及時調(diào)整治療方案、合理用藥及提高療效具有重要意義。本實

2、驗利用錯配PCR擴增技術(shù)進行HBVP基因YMDD變異的檢測，以評價其臨床應(yīng)用價值，并對HBVP基因YMDD變異的臨床意義進行初步探討。 方法采用基因擴增技術(shù)檢測時，其中一條引物3'端第2位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基不互補。根據(jù)YMDD變異的位點，分別設(shè)計不同的引物，擴增出需要得到的不同變異位點的DNA片段。 1.應(yīng)用分子克隆方法建立陽性對照系統(tǒng)，構(gòu)建YMDD、YVDD、YIDD的陽性質(zhì)粒。 2.對所構(gòu)建的質(zhì)粒應(yīng)用P

3、CR方法、酶切鑒定及直接測序方法進行鑒定，并且進行敏感性及特異性試驗。 3.對65例未經(jīng)抗病毒治療的乙型肝炎患者檢測其YMDD變異情況。 4.對30例經(jīng)拉米夫定治療一年，HBVDNA持續(xù)陽性的患者，檢測其YMDD變異情況。 結(jié)果1.應(yīng)用PCR方法、酶切鑒定及直接測序方法證實構(gòu)建的YMDD、YVDD、YIDD質(zhì)粒序列正確。 2.YMDD、YVDD、YIDD質(zhì)粒具有較高的敏感性和特異性，三種質(zhì)?？蓹z測出的最低

4、濃度分別為1.87copies/μl、1.53copies/μl、1.53copies/μl。YMDD質(zhì)粒在濃度為1.87×109copies/μl、YVDD、YIDD質(zhì)粒在1.53×108copies/μl以下時不出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 3.65例未經(jīng)拉米夫定治療的乙型肝炎患者中6例存在YMDD變異，陽性率為9.07％。其中YIDD和YI/YMDD各1例，YVDD3例，YV/YMDD1例。出現(xiàn)變異者與未出現(xiàn)變異者的肝功能和HBVDN

5、A水平比較無明顯差異。 4.30例經(jīng)拉米夫定治療一年，HBVDNA仍為陽性的患者，半年變異發(fā)生率為16.67％，分別是YVDD2例、YIDD1例、YI/YMDD2例；一年變異發(fā)生率為13.33％，分別是YIDD1例、YI/YMDD3例。出現(xiàn)變異與未變異者的肝功能和HBVDNA水平比較無明顯差異YMDD變異從年齡分布看，35歲以上出現(xiàn)變異明顯高于35歲以下者。 結(jié)論1.在未經(jīng)拉米夫定治療的患者中可以出現(xiàn)YMDD變異，表明抗

6、病毒藥物壓力不是導(dǎo)致HBVYMDD變異的唯一因素。 2.YMDD變異可發(fā)生在長期使用拉米夫定治療無效的患者中，提示抗病毒藥物壓力仍是導(dǎo)致YMDD變異的重要因素。 3.拉米夫定治療一年無效患者中，半年時可出現(xiàn)YMDD變異，變異可隨時間推移而改變，變異發(fā)生后肝功能和HBVDNA水平并未出現(xiàn)明顯變化。 4.本研究建立的檢測YMDD變異方法的敏感性、特異性較好，具有操作簡便、實用、成本低的優(yōu)點，可作為檢測YMDD變異的一