妊娠相關(guān)血漿蛋白A酶聯(lián)免疫檢測方法的建立及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:建立一種針對人外周血妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)的生物素-親和素酶聯(lián)免疫學(xué)檢測(ELISA)方法,并運用此方法對臨床上相關(guān)疾病的PAPP-A水平進行檢測,了解其臨床應(yīng)用價值,指導(dǎo)相關(guān)疾病的診斷和治療。
　　 方法:
　　 1.PAPP-A蛋白純:采集足夠量妊娠足月孕婦混合血清,經(jīng)透析后,根據(jù)PAPP-A的分子結(jié)構(gòu)和理化特性,選擇兩種經(jīng)濟高效的層析介質(zhì):Sephadex G-200凝膠、陰離子交換劑,經(jīng)SDS-

2、PAGE凝膠電泳及免疫印跡進行蛋白鑒定。
　　 2.抗體標(biāo)記及純化:(1)改良過碘酸鈉法HRP標(biāo)記抗PAPP-A mAb-10E1,酶結(jié)合物經(jīng)分子篩凝膠過濾層析進行純化。(2)生物素標(biāo)記抗PAPP-A mAb-10E2,用透析的方法去除游離的生物素,達到純化的目的。
　　 3.方法學(xué)建立及反應(yīng)條件優(yōu)化:將微孔板包被生物素化牛血清白蛋白(BBC)、及鏈霉親和素,與生物素化的抗PAPP-A mAb反應(yīng),建立間接包被酶聯(lián)免疫檢

3、測法。用棋盤滴定法對微孔板最佳包被濃度、抗體最優(yōu)工作濃度及反應(yīng)時間、溫度等條件進行優(yōu)化。
　　 4.方法學(xué)評價:進行靈敏性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等參數(shù)評價,并與國外同類:PAPP-A檢測試劑盒進行相關(guān)性比較。
　　 5.初步臨床應(yīng)用:(1)妊娠早期(8～14周)孕婦血清中:PAPP-A含量測定,分析其含量與孕婦年齡、體重、孕周的關(guān)系；(2)急性冠脈綜合癥(ACS)患者血清中PAPP-A含量測定,分析其疾病相關(guān)性,并以正

4、常人血清作為陰性對照。
　　 結(jié)果:
　　 1.PAPP-A蛋白純化:建立了一整套簡單、經(jīng)濟、適用的PAPP-A層析工藝,獲得較高純度的PAPP-A蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳圖中只見一條分子量約為200kD的清晰蛋白質(zhì)條帶,免疫印跡顯示主要純化產(chǎn)物即為PAPP-A。
　　 2.抗體標(biāo)記:酶結(jié)合物經(jīng)Sephadex G-200分子篩凝膠過濾層析后,收集的第一峰即為標(biāo)記HRP的抗PAPP-AmAb,即酶標(biāo)抗體。測

5、定酶結(jié)合物的量:0.9g/L,抗體為0.31g/L。
　　 3.方法學(xué)建立及反應(yīng)條件優(yōu)化:(1)棋盤滴定結(jié)果顯示,生物素化牛血清白蛋白最佳包被濃度1:3000(3.33μg/ml),鏈霉親和素包被濃度1:4000(3.0μg/ml)。(2)生物素化抗體及酶標(biāo)抗體最佳工作濃度均為1:4000。(3)系列標(biāo)準(zhǔn)品為純化PAPP-A抗原稀釋所得,濃度分別為:0,1,2.5,5,10,25,50μg/ml,本試劑盒的檢測范圍為0.31～5

6、0μg/ml。(4)最適反應(yīng)溫度為37℃,時間為30min。
　　 4.方法學(xué)評價:本文所建立的方法靈敏性為0.31μg/ml,回收率均在95％～100％之間；線性、穩(wěn)定性及特異性良好；批內(nèi)變異系數(shù)(CV)均不大于10％,批間CV均不大于15％；與國外同類方法進行相關(guān)性分析,r=0.982,提示兩種檢測方法高度相關(guān)。
　　 5.初步臨床應(yīng)用:(1)以160例正常妊娠早期孕婦(8～14周)為研究對象,篩查唐氏綜合征,結(jié)果發(fā)

7、現(xiàn):正常妊娠孕婦不同孕周血清PAPP-A濃度中位數(shù)水平隨著孕周的增加而增加,這與文獻報道一致；此外還發(fā)現(xiàn):高齡孕婦(≥35歲)血清PAPP-A濃度明顯比低齡孕婦的低；隨著孕婦體重指數(shù)的增加,血清PAPP-A濃度相對降低,而且這種降低是呈直線相關(guān)的。(2)50例ACS患者血清,經(jīng)測定分析,結(jié)果顯示,該方法靈敏度不夠,需進一步研究提高靈敏度。
　　 結(jié)論:
　　 1.建立了一整套簡單、經(jīng)濟、適用的PAPP-A層析工藝,獲得較