沙門菌PCR檢測方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、沙門菌(Salmonella)是一種重要的食源性病原菌，可引起人和動物腸胃炎、傷寒、菌血癥、腸道之外定殖感染(骨髓炎，血管內(nèi)的感染或是病灶性膿腫)、Reiter's綜合癥等多種疾病。人和動物常因攝入被沙門菌污染的食物、水，或是與患者接觸而感染。目前許多發(fā)達國家己建立起完善的監(jiān)測和控制體系，并對該菌進行了較為深入的研究。本研究的目的是：(1)建立沙門菌PCR檢測新方法；(2)使用不同類型的樣品評價PCR方法；(3)對本研究獲得的分離株應(yīng)用

2、2007年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)推薦使用的瓊脂擴散法進行耐藥分析。 一、沙門菌PCR檢測方法的建立 以沙門菌腸毒素stn基因作為靶基因，建立沙門菌的PCR檢測方法。對沙門菌屬A-F群17株沙門菌進行特異性檢測，17株沙門菌經(jīng)PCR擴增，在260 bp處分別出現(xiàn)屬特異性條帶，說明該方法無假陰性。對埃希氏菌屬的大腸桿菌標準株(ATCC25922)、腸出血性大腸桿菌EHEC、腸致病性大腸桿菌EPEC、腸侵襲

3、性大腸桿菌ETEC，克雷伯氏菌屬的肺炎克雷伯桿菌，志賀氏菌屬痢疾桿菌、福氏2a志賀氏菌，變形桿菌屬的普通變形桿菌、奇異變形桿菌，檸檬酸桿菌屬的弗氏檸檬酸桿菌，腸桿菌屬的陰溝腸桿菌，普羅威登菌屬的普羅威登斯菌，假單胞菌屬的銅綠假單胞菌，糞鏈球菌，葡萄球菌，蠟樣芽孢桿菌，乳酸桿菌共17種非沙門菌進行了特異性檢測，均無特異性條帶出現(xiàn)。這表明該PCR方法具有良好的特異性。該方法可以直接檢出人工污染的樣品，可檢測到43.85pg沙門菌DNA，增菌

4、后PCR最低檢測限為ICFU。綜上所述，本研究建立了沙門菌的PCR檢測方法，該方法具有良好的特異性、敏感性，適合沙門菌的檢測，為沙門菌監(jiān)測提供了新方法。 二、PCR方法的初步應(yīng)用 在2008年7月-2009年1月，隨機采集禽源的肛拭、肝臟病料和雞蛋樣品共1082份，豬源的肛拭、肉類和淋巴結(jié)樣品共466份，揚州地區(qū)環(huán)境和游泳池水樣共58份。用PCR方法檢測這三種來源的樣品，并進行沙門菌的分離。結(jié)果顯示：1082份禽源樣

5、品檢出41份陽性，466份豬源樣品檢出15份陽性，58份水源樣品檢出2份陽性，共獲得58株分離株，經(jīng)國標方法驗證為沙門菌。通過大量樣本驗證了本研究建立的PCR方法適用于禽源、豬源、水源樣品的檢測，而且適用于不同類型的樣品檢測如：肛拭、肝臟、水樣、肉類樣品等。 三、沙門菌分離株的耐藥性分析 采用2007年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)推薦使用的瓊脂擴散法對100株沙門菌的耐藥性進行了研究。 藥敏結(jié)果顯

6、示，沙門菌的耐藥性較高，而且多重耐藥狀況不容樂觀。結(jié)果表明，100株沙門菌對頭孢類抗生素敏感，但是對萘啶酸、四環(huán)素和鏈霉素產(chǎn)生了較強的耐藥性。耐藥譜的分析結(jié)果顯示，100株分離株的多重耐藥主要集中在2耐到5耐和13耐，占78.13％。這些數(shù)據(jù)表明，在我國，沙門菌的多重耐藥的現(xiàn)象十分嚴重，耐藥譜也比較寬，有4株沙門菌分離株對13種抗生素同時產(chǎn)生了耐藥性。本研究中不同樣品來源的分離株對不同種類抗生素的敏感性存在一定的差異，因此在臨床上應(yīng)用抗